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m1A RNA甲基化对直肠腺癌的诊断效能分析

2024-12-18 117 上传者：管理员

摘要：目的探索m1A相关基因表达和血浆m1A总体甲基化水平对直肠腺癌诊断和预后的预测价值。方法根据Sangerbox(基于TCGA和GTEx数据库)在线平台分析11个m1A甲基化相关基因在直肠腺癌中的差异表达，结合临床数据进行诊断效能和生存分析。同时，通过检测血浆m1A甲基化水平在直肠腺癌患者和正常人中差异情况，分析其对直肠腺癌的诊断价值。结果 TRMT6,一种关键的m1A编码器基因，在不同病理状态的直肠腺癌中升高最为显著，并可作为直肠腺癌，特别是早期直肠腺癌的诊断标志物，其特异性和灵敏性高达82.86%和90.00%,而且TRMT6的高表达也预示着直肠腺癌预后较好(HR=0.22,95%CI:0.08～0.60,P=0.0014)。同时，血浆m1A甲基化水平在直肠腺癌相对于正常人显著性升高，对早期直肠腺癌有一定的诊断价值，其AUC约为0.8。结论 m1A相关基因和血浆m1A甲基化在直肠腺癌中升高，可作为其潜在的早期诊断标志物。本研究为直肠腺癌早期诊断提供新的靶标，将有助于指导制定更有效的治疗策略。

关键词：
m1A甲基化
消化道
直肠腺癌
诊断
诊断策略
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结直肠癌是我国以及世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率均居癌症前列[1]。流行病学调查研究显示，我国结直肠腺癌的发病率居所有恶性肿瘤的第4位，病死率居第5位[2]。其中直肠腺癌占结直肠腺癌的75%～85%,是消化道最常见的恶性肿瘤。直肠腺癌恶性程度极高，早期无明显症状，中晚期5年生存率低于70%,严重威胁患者的生命安全及预后。直肠腺癌是具备早期筛查和诊断策略的癌症，使其死亡率大大降低，其中在高收入国家的过早死亡率下降幅度较低收入国家更高(83%vs14%)[3]。因此，积极寻找与直肠腺癌发病相关，且可用于诊断直肠腺癌、评估直肠腺癌患者预后的指标具有重要的临床和社会意义。

肠镜检查被广泛认为是筛查和诊断结直肠癌的黄金标准。然而，肠镜检查是一种侵入性检查，具有出血和穿孔等固有风险。目前美国胃肠病学会和中华医学会胃肠病学会等机构提倡对结直肠癌进行“两步”筛查[4-5]。初始阶段采用低侵入性筛查技术，如血液学检测和粪便DNA检测。血液学检测以其简单、快速、安全和微创而闻名，可以捕捉结直肠癌进展的不断变化，在筛查和识别“表面上”健康人群中的高风险个体方面很有价值[6]。最新的研究显示，以血液cfDNA的LASS4、LRRC4、PPP2R5C和ZDHHC1 DNA甲基化筛查模型对结直肠腺癌的检测敏感性高达93.9%(95%CI:87.1%～97.7%),特异性为92.7%(95%CI:92.2%～93.1%)[7]。

自从2014年，FDA批准全球第一款基于DNA甲基化用于结直肠癌高危风险人群筛查以来，以DNA甲基化为代表的表观遗传学在结直肠癌的诊断中显得日渐重要。近年来，RNA分子腺嘌呤第1位氮原子上的甲基化修饰(N1-methyladenosine, m1A)作为一种新的RNA甲基化修饰类型逐渐成为研究热点。研究表明，m1A是真核生物tRNA和rRNA丰度很高的一种转录后修饰，同时也大量存在于mRNA。m1A RNA甲基化是一个动态可逆的修饰过程，从催化形成到功能实现主要受m1A甲基转移酶复合物(Writers,编码器)、m1A去甲基化酶(Erasers,消码器)和m1A读取蛋白(Readers,读码器)来调控。m1A对RNA稳定性和翻译起始等过程有着重要调节作用，并参与到肝癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和小胶质瘤等重要疾病的发生发展中[8-10]。但迄今少见m1A或其相关分子标志物来预测直肠腺癌的发生和预后，限制了m1A在指导直肠腺癌诊断和治疗中的应用。

本研究通过系统的生物信息学分析和临床实验检测，探讨m1A相关基因和血浆m1A甲基化在直肠腺癌患者和正常人群中的水平差异，分析二者与直肠腺癌临床病理特征和生存状态之间的关系，预测其对直肠腺癌的诊断和预后价值，以期为临床诊断和治疗提供新的理论指导依据。

1、资料与方法

1.1实验材料

数据库样本：本研究从Sangerbox(基于TCGA和GTEx数据库)在线平台下载并整理m1A RNA甲基化相关基因在直肠腺癌的转录组学数据及临床数据[11]。数据库包括92例直肠腺癌组织样本和10例正常直肠组织样本，并具有完整的临床信息，包括年龄、性别、病理分级、肿瘤TNM分期、生存时间和生存状态。由于以上数据属于公开获取资源，因此本研究免于伦理委员会的批准。

直肠腺癌患者和正常人血浆样本：选取我院初诊且经病理证实的直肠腺癌患者98例作为观察组，男65例，女33例，年龄(59.69±10.43)岁(30～80岁);淋巴结转移58例，无淋巴结转移40例；临床Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期64例。纳入标准：临床资料完整的患者且经病理检查确诊的患者。排除标准：合并其他恶性肿瘤、感染、凝血功能障碍的患者。另选取105名健康体检者作为对照组，男67名，女38名，年龄(58.14±9.57)岁(32～75岁)。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。所有参与者已签署知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1 m1A RNA甲基化相关基因：

通过文献检索，共收集到11个m1A RNA甲基化关键相关基因，包括4个编码器(Writer)基因(TRMT6、TRMT61A、TRMT61B和TRMT10C),3个消码器(Eraser)基因(ALKBH1、ALKBH3和FTO)和4个读码器(Reader)基因(YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3和YTHDC1)。根据11个m1A甲基化相关基因的表达谱及临床数据，进行后续分析。

1.2.2 m1A相关基因差异表达分析：

采用“limma”和“gpurb”R软件包来识别正常组和肿瘤组之间的11个m1A RNA甲基化相关基因的差异表达，并进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.3 m1A相关基因对直肠腺癌诊断和预后的分析验证：

采用“pROC”R软件包(1.18.0)生成ROC曲线用来检测直肠腺癌的诊断价值，计算AUC,并计算其约登指数、最佳灵敏性和特异性。

采用Log-rank分析直肠腺癌总体死亡率与m1A RNA甲基化相关基因mRNA表达水平的相关性，同时使用Kaplan-Meier法计算生存时间及累积生存率，并绘制其生存曲线。以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2.4血浆m1A RNA甲基化总体水平检测方法：

直肠腺癌患者和正常人禁食8 h后，采集EDTA抗凝的静脉血5 mL,以3 000 r/min在4℃下离心10 min,分离血浆后储存于-80℃下备用。血浆m1A RNA甲基化水平采用美国Raybiotech有限公司(批号：EIA-m1A-1)的酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进行检测。根据说明书进行实验操作，数据处理使用GraphPad Prism 8.0软件绘制的标准曲线，并计算血清中m1A水平。每个标准品和样本均重复两次。

1.3统计学分析

使用SPSS 23.0和GraphPad Prism 10.0对所有数据进行统计分析和作图。计量资料以

表示。采用Student’st检验、Wilcoxon rank-sum检验用于检测直肠腺癌组织与正常直肠组织基因表达差异，Benjamini-Hochberg(BH-FDR)用于调整多个变量多重比较的P值。对于预后分析，采用Log-rank检验不同m1A甲基化相关基因表达量对癌症预后的预测价值。同时绘制ROC曲线，获取最佳截断值、AUC、敏感度和特异度等。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1直肠腺癌中表达上调的TRMT6基因可作为直肠腺癌的诊断和预后标志物

为研究m1A相关基因在直肠腺癌中的表达模式，我们进入Sangerbox系统选择TCGA-GTEx数据库，对11种m1A相关基因在直肠腺癌和正常组织中进行差异表达分析。结果如图1A所示，相对于正常直肠组织，3种m1A编码器基因(TRMT6、TRMT61B和TRMT10C)和1种读码器基因(YTHDF1)的表达水平在直肠腺癌组织中表达均显著性升高，而3个消码器基因(ALKBH1、ALBH3和FTO)的表达则无明显差别。结果提示：直肠腺癌中m1A编码器基因的表达升高可显著性地增加细胞内外m1A甲基化修饰水平，同时读码器基因的表达升高可使m1A甲基化修饰后的功能加强。其中，编码器基因TRMT6 mRNA以1.3倍的升高趋势在直肠腺癌的差异表达中最为显著。同时，统计分析发现TRMT6在直肠腺癌的不同肿瘤分期、淋巴结和肿瘤转移状态以及不同生存状态中的表达均明显高于正常组织，并且在不同病理时期或状态下的TRMT6表达无明显差别(见图1B)。

为进一步研究TRMT6对直肠腺癌的诊断/预后性能，我们采用ROC分析发现其AUC在不同肿瘤分期、淋巴结和肿瘤转移状态，不同生存状态及全部的直肠腺癌中均达到0.8以上(见图1C)。其中，TRMT6对早期(Ⅰ期)直肠腺癌的诊断灵敏性和特异性分别为82.86%和90.00%。采用Kaplan-Meier法分析发现：TRMT6 mRNA高表达组直肠腺癌的总体生存率明显高于低表达组(HR=0.22,95%CI:0.08～0.60,P<0.001,见图1D)。结果显示TRMT6不仅可以作为直肠腺癌，特别是早期直肠腺癌的分子诊断标志物，而且TRMT6的高表达预示着直肠腺癌预后好。

图1差异表达的m1A相关基因对直肠腺癌的诊断和预后分析

2.2血浆m1A总体甲基化水平在直肠腺癌明显升高，并可作为早期癌症诊断标志物

TRMT6表达增加可能预示着细胞内外m1A总体甲基化水平增加。为验证这一结果，收集我院直肠腺癌患者和正常人的血浆样本，采用ELSIA法检测了血浆m1A甲基化水平。结果发现，相对于正常人，血浆m1A甲基化水平在直肠腺癌患者中显著升高[(517.751±400.192)ng/mLvs(219.734±172.639)ng/mL,P<0.001,见图2A]。ROC曲线显示m1A甲基化水平对直肠腺癌诊断效能的AUC为0.770(95%CI:0.706～0.835,P<0.0001,见图2B),最佳灵敏性和特异性分别为82.65%和71.58%。同时，m1A甲基化总体水平在早期(Ⅰ&Ⅱ期)直肠腺癌中显著升高，且并未随着肿瘤分期、分级、淋巴结和肿瘤细胞的转移增加而明显增加(见图2C)。血浆m1A甲基化水平的AUC值在各期和全部直肠腺癌之间差异均无统计学意义，均在0.73～0.88之间(见图2D)。在Ⅰ～Ⅱ期的灵敏性和特异性分别为83.33%和69.54%。然而血浆m1A甲基化水平在不同性别或年龄之间(包括直肠腺癌患者和正常人)均无差异(见图2E～2F)。结果表明血浆m1A总体甲基化水平在各个时期和转移状态直肠腺癌均明显升高，可作为癌症早期诊断标志物。

图2血浆m1A在直肠癌患者和正常人中的水平差异以及对直肠腺癌的诊断效能分析

3、讨论

本研究率先探讨了血浆m1A RNA甲基化在直肠腺癌中的诊断价值，我们首先在大数据库中发现以TRMT6为主的m1A甲基化编码器基因在直肠腺癌组织中显著性的增加，同时试验检测发现血浆m1A甲基化水平在直肠腺癌患者中也明显的升高。组织中的TRMT6 mRNA和血浆中的m1A总体水平甲基化对直肠腺癌，特别是早期直肠腺癌的诊断价值较高。二者的诊断效能独立于直肠腺癌的分期、淋巴结和肿瘤转移状态和生存状态。组织中的TRMT6 mRNA的高表达也预示着直肠腺癌患者的预后较高，有着更长的生存期。研究提示直肠腺癌组织中m1A甲基化编码器基因(methyltransferase 6,TRMT6)表达的升高可增加细胞内外m1A甲基化水平，有望成为直肠腺癌早期诊断和预后的一种新的生物学标志物。

研究表明，表观遗传学的改变(特别是DNA甲基化及组蛋白修饰)可以作为结直肠腺癌发生的分子驱动力，与基因突变一起促使正常直肠黏膜发展为结直肠腺癌。表观遗传学的改变具有可逆性和可调控性，为结直肠腺癌的预防、诊断、治疗及预后提供了广阔的思路。目前的研究已经证实：组织、粪便和血液中基因的异常DNA甲基化在结直肠腺癌患者的早期筛查和诊断中具有很高的敏感性和特异性[12-14]。其中针对胞裂蛋白9(septin 9,SEPT9)、多配体聚糖2前体(syndecan 2 precursor, SDC2)、波形蛋白(vimentin, VIM)的DNA甲基化检测试剂盒已被美国FDA和中国国家药品监督管理局批准用于结直肠腺癌筛查并写入指南[7,15]。本研究发现的m1A总体甲基化水平的改变也是一种潜在的新的直肠腺癌生物学诊断标志物。

以往的研究基于m1A相关基因的组合建立了结直肠癌的诊断和预后指标[12],然而该研究是基于71个m1A相关基因得出的预测模型。模型中纳入的基因参数过多势必会增加模型的不稳定性，同时也会限制其临床转化应用。本研究经过筛选得到1个关键m1A编辑器基因——TRMT6,并对直肠腺癌有着较高的诊断效能，其灵敏性和特异性在早期直肠腺癌分别为82.86%和90.00%。TRMT6是m1A甲基化的最重要的催化酶基因，负责细胞核RNA m1A甲基化修饰生成[16-19]。同时由于3个消码器基因(ALKBH1、ALBH3和FTO)在直肠腺癌和正常直肠组织中的表达无明显差别，更加凸显了TRMT6可能是直肠腺癌m1A甲基化水平升高的最主要基因。更为重要的是一种读码器基因(YTHDF1)的表达水平在直肠腺癌组织中表达也显著升高，这就更加加强了m1A在直肠腺癌中的功能，比如促进RNA结构和表达的稳定性、与蛋白质的相互作用、细胞自我更新能力、细胞增殖和细胞死亡等[20],这些功能将在直肠腺癌发生发展过程中发挥重要作用。

研究表明，肿瘤细胞内受表观修饰的基因可以释放入血，并作为血浆生物学标志物用于指导肿瘤的诊断和治疗疗效。其中最为明确的是5mC DNA甲基化修饰基因可随着细胞的凋亡或死亡从细胞内释放到血浆，作为结直肠腺癌[21]、前列腺癌[22]、胰腺癌[23]、肺癌[24]和肝癌[25]和泛癌[26-27]等血浆灵敏而特异的诊断和筛查标志物。同样的，结直肠癌和肺癌中m6A RNA甲基化的修饰基因也可释放入血作为其潜在生物学标志物[28-29]。同m6A RNA类似，我们发现直肠腺癌细胞中增加的m1A RNA总体甲基化同样可以释放入血，并能有效的将直肠腺癌从正常人中区分出来。血浆m1A水平对不同时期直肠腺癌诊断的AUC为0.7～0.8,使其成为中等诊断标志物级别，并独立于肿瘤的分期、分级、淋巴结和肿瘤的转移。

本研究基于单个m1A编码器基因TRMT6在直肠腺癌组织中的表达显著增加，导致血浆中m1A总体水平升高。组织中TRMT6和血浆m1A均可作为直肠腺癌，特别是早期直肠腺癌潜在的诊断标志物，这为直肠腺癌的早期诊断和治疗提供了新的视角。

基金资助:河南省联合共建项目(LHGJ20230361);

文章来源:朱立强,孙金旗,冀恒涛,等.m1A RNA甲基化对直肠腺癌的诊断效能分析[J].胃肠病学和肝病学杂志,2024,33(12):1620-1624.