食管癌(EC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤，也是全球重大公共卫生问题。近年来，EC的发病率逐渐增加，男性EC的发病率高于女性[1]。在中国，食管鳞癌(ESCC)是最常见的EC组织学类型。导致ESCC的潜在因素可能是吸烟、酗酒、喝热水、吃太热的食物和其他不良习惯[2]。大多数ESCC患者由于缺乏明显的临床症状而被诊断为晚期，这些患者通常会出现淋巴结转移，导致临床结局不佳[3]。尽管ESCC的诊断和治疗方法取得了巨大进步，但ESCC的疗效并不令人满意[4]。因此，揭示ESCC进展的分子机制，确定ESCC值得信赖的治疗靶点是必不可少的。miRNA是小的非编码RNA成员，由长度为19至24个核苷酸组成，其与靶mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)相互作用并抑制蛋白表达。鉴于miRNA在肿瘤侵袭、转移和复发中的重要作用，人们发现关键候选miRNA的鉴定可以作为ESCC的治疗靶点进行进一步研究[5]。Chen等[6]发现，miR-140-3p的过表达抑制细胞增殖和侵袭。此外，miR-140-3p过表达减缓了裸鼠体内ESCC肿瘤的生长。我们通过TargetScan网站以及双荧光素酶报告基因实验发现miR-140-3p调控白介素8(CXCL8)。而Hosono等[7]发现，CXCL8在ESCC患者体内高表达，CXCL8通过促进癌细胞的迁移和侵袭来促进ESCC进展。但miR-140-3p是否可以通过下调CXCL8对ESCC产生影响还未可知。因此本研究旨在探究现miR-140-3p通过下调CXCL8对ESCC细胞增殖、迁移和侵袭的影响，以期为ESCC治疗提供数据参考。

1、材料与方法

1.1材料

正常人食管鳞状上皮细胞系(Het-1A)、ESCC细胞系EC109购自生物风公司；CCK8细胞增殖与毒性检测试剂盒购自艾美捷科技有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自弗元(上海)生物科技有限公司；miR-NC、miR-140-3p mimic、pcDNA-NC、pcDNA-CXCL8均购自上海生工；CXCL8、上皮钙粘附素(E-cadherin)、神经型钙粘附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和GAPDH抗体购自Abcam。

1.2细胞培养和转染

在补充有10%热灭活胎牛血清和抗生素(100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素)的Dulbecco改良Eagle培养基中传代培养所有细胞系。

将EC109细胞分为：miR-NC组(转染miR-NC)、miR-140-3p组(转染miR-140-3p mimic)、miR-140-3p+CXCL8-NC组(细胞共转染miR-140-3p mimic和pcDNA-NC)、miR-140-3p+CXCL8组(细胞共转染miR-140-3p mimic和pcDNA-CXCL8)。转染过程参照Lipofectamine 2000试剂盒，未做任何处理的EC109细胞记为NC组，转染24 h后用于后续实验。

1.3双荧光素酶报告基因实验

将含有miR-140-3p结合位点的野生型CXCL8序列和不含miR-140-3p结合位点的突变型CXCL8序列克隆到pmirGLO载体中，分别命名为WT-CXCL8、MUT-CXCL8,然后分别与mimic-NC或miR-140-3p mimic共转染到EC109细胞中，分别记为miR-NC+WT-CXCL8组、miR-140-3p mimic+WT-CXCL8组、miR-NC+MUT-CXCL8组、miR-140-3p mimic+MUT-CXCL8组。培养2 d后使用双荧光素酶报告基因检测系统检测EC109细胞的荧光素酶活性。

1.4 qRT-PCR检测miR-140-3p表达

使用TRIzol试剂提取细胞内总RNA,将RNA逆转录为cDNA,随后进行qRT-PCR扩增。根据2-ΔΔCT方法计算基因相对表达水平，U6用于标准化miR-140-3p表达水平。实验中使用的所有引物序列为miR-140-3p(F:5'-TGTGTCCTGCCAGTGGTTTT-3',R:5'-GTCCGTGGTTCTACCCTGTG-3'),U6(F:5'-GCTTCGGCAG-CACATATACTAAAA-3',R:5'-CGCTTCACGAATTTGCG-TGTCAT-3')。

1.5 Western blot检测CXCL8以及上皮间质转化(EMT)蛋白表达

通过RIPA裂解缓冲液提取Het-1A和EC109细胞的总蛋白，并使用BCA测定试剂盒检测总蛋白的浓度。最后，蛋白质(25μg)在10%SDS-PAGE凝胶上电泳分离，电转移到硝酸纤维素膜上。然后，将所有膜与5%脱脂牛奶一起孵育1 h,将膜与以下一抗一起孵育：CXCL8(1∶1000)、E-cadherin(1∶1000)、N-cadherin(1∶1000)、Vimentin(1∶1000)和GAPDH抗体(1∶1000)。第二天，用HRP缀合的第二抗体(山羊抗小鼠IgG第二抗体，1∶5000)室温孵育1 h后。最后，ECL显色，ImageJ软件用于蛋白质灰度分析。

1.6 CCK-8法检测EC109活性

转染后，将细胞置于96孔板中，每个孔含有100μl完全培养基(1×103个细胞)。生长24 h后加入20μl CCK-8试剂孵育(0.5 mg/ml)15 min。最后，在450 nm处检测吸光度。

1.7流式细胞术检测EC109凋亡情况

转染后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶消化细胞，并收集在流管中。离心除去上清液后结合缓冲液重悬。加入膜联蛋白V-FITC、碘化丙啶(PI)避光孵育30 min。通过流式细胞仪评估EC109凋亡。

1.8 Transwell法测定EC109细胞的侵袭和迁移能力

收获细胞并将其重悬于无血清培养基中。对于迁移测定，将2.5×104个细胞接种Transwell上室中。对于侵袭测定，将2.5×104个细胞接种到涂有Matrigel基质胶的Transwell上室中。将含有10%FBS的培养基加入底部腔室中。在37℃下孵育24 h后，去除膜上表面的细胞，并用多聚甲醛在4℃下固定膜下表面入侵或迁移细胞的15 min,然后在室温下用0.1%结晶紫染色15 min。在光学显微镜下计数侵入或迁移的细胞数量。

1.9统计学分析

所有数据均在25.0版SPSS软件处理，数据经正态分布、方差齐性检验后以平均值±标准差表示，t检验用于两组间的比较，多组间比较用单因素方差分析(one-way ANOVA),进一步两组间的比较用SNK-q检验，P<0.05表示差异显著。

2、结果

2.1 miR-140-3p靶向调控CXCL8

通过TargetScan网站发现miR-140-3p与CXCL8存在结合位点。与miR-NC+WT-CXCL8组比较，miR-140-3p mimic+WT-CXCL8组EC109细胞的荧光素酶活性显著下降(P<0.05),miR-140-3p mimic+MUT-CXCL8组较miR-NC+MUT-CXCL8组EC109细胞荧光素酶活性无显著差异(P>0.05),见图1,表1。

图1 TargetScan网站预测miR-140-3p与CXCL8的结合点

表1双荧光素酶报告基因实验验证miR-140-3p与CXCL8的靶向关系

2.2 miR-140-3p、CXCL8在细胞中的表达

与Het-1A相比，EC109细胞中CXCL8水平均显著上调(P<0.05),miR-140-3p显著下调(P<0.05),见图2,表2。

图2 Western blot检测细胞中CXCL8、Wnt、β-catenin蛋白水平

表2 miR-140-3p、CXCL8蛋白在细胞中的表达

2.3 miR-140-3p、CXCL8在EC109细胞中的表达

与NC组、miR-NC组相比，miR-140-3p组CXCL8水平显著下降(P<0.05),miR-140-3p表达量显著上升(P<0.05);与miR-140-3p组、miR-140-3p+CXCL8-NC组相比较，miR-140-3p+CXCL8组CXCL8水平显著增加(P<0.05),见图3,表3。

图3 Western blot检测EC109细胞CXCL8、Wnt、β-catenin蛋白表达

2.4过表达miR-140-3p或上调CXCL8对EC109细胞增殖的影响

与NC组、miR-NC组相比，miR-140-3p组EC109细胞OD450值显著减小(P<0.05);与miR-140-3p组、miR-140-3p+CXCL8-NC组相比较，miR-140-3p+CXCL8组细胞OD450值显著增加(P<0.05),见表4。

表3 miR-140-3p、CXCL8蛋白在EC109细胞中的表达

表4过表达miR-140-3p或上调CXCL8对EC109细胞OD450值的影响

2.5过表达miR-140-3p或上调CXCL8对EC109细胞凋亡的影响

与NC组、miR-NC组相比，miR-140-3p组EC109细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与miR-140-3p组、miR-140-3p+CXCL8-NC组相比较，miR-140-3p+CXCL8组EC109细胞凋亡率显著下降(P<0.05),见图4,表5。

2.6过表达miR-140-3p或上调CXCL8对EC109细胞侵袭、迁移以及EMT的影响

miR-140-3p组较NC组、miR-NC组EC109细胞侵袭、迁移细胞数量、N-cadherin、Vimentin蛋白水平显著下调(P<0.05),E-cadherin蛋白水平显著上调(P<0.05);miR-140-3p+CXCL8组较miR-140-3p组、miR-140-3p+CXCL8-NC组EC109细胞侵袭、迁移细胞数量、N-cadherin、Vimentin蛋白水平显著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白水平显著下降(P<0.05),见表6～7,图5～6。

3、讨论

EC是消化系统恶性肿瘤之一，死亡率在全球癌症中居第六位，在中国居第四位。根据最新的2020年全球癌症统计数据，EC病例数高达588113例[8]。ESCC是中国的主要EC类型，约占EC病例的90%,仍然是最致命的恶性肿瘤之一，也是主要的健康负担[9]。EC的预后极差，5年生存率较低，约为20%[10]。因此，有必要对ESCC进展的潜在机制提供新的见解，从而确定潜在的治疗靶点，尽早制定有效的治疗方案。

图4流式细胞术检测EC109细胞凋亡

表5过表达miR-140-3p或上调CXCL8对EC109细胞凋亡率的影响

表6过表达miR-140-3p或上调CXCL8对EC109细胞侵袭和迁移细胞数量的影响

表7各组EC109中EMT相关蛋白表达比较

图5 Transwell检测EC109细胞迁移、侵袭

最近的研究表明，miRNA参与ESCC起始和进展的调节[11]。miR-140-3p是一种关键的miRNA,在各种癌症中充当肿瘤抑制因子。据报道，miR-140-3p抑制结直肠癌[12]、乳腺癌[13]和肺癌[14]的恶性进展。此外，miR-140-3p在ESCC组织中被证明下调[15]。miR-140-3p与肿瘤大小、组织学分级、肿瘤分期、转移以及ESCC患者的生存率较差有关，过表达miR-140-3p抑制了ESCC细胞增殖、迁移和侵袭，并减少体内肿瘤的生长[6]。而在本实验中，与正常人食管鳞状上皮细胞系Het-1A相比，miR-140-3p在人ESCC细胞中明显低表达。进一步暗示miR-140-3p可能是ESCC的靶基因，过表达miR-140-3p可能抑制ESCC的发展。EMT可增加多种癌细胞活力、增殖、侵袭和迁移能力，与复发和转移密切相关，在EMT过程中，E-cadherin下调失去上皮特征，N-cadherin和Vimentin上调获得间质表型。ESCC细胞经过EMT过程获得迁移和侵袭的能力，随后通过血液和淋巴管途径进一步扩散，进而发展为晚期ESCC[16]。先前研究表明，miR-140-3p过表达可以抑制卵巢癌的迁移、侵袭和EMT转化[17]。而在本研究中，miR-140-3p过表达显著降低了EC109细胞OD450值、迁移、侵袭细胞数量、N-cadherin、Vimentin蛋白水平，显著升高了EC109细胞凋亡率、E-cadherin蛋白水平，进一步证实miR-140-3p过表达可以抑制EC109细胞EMT,抑制其迁移和侵袭能力，进而抑制早期ESCC发展为晚期ESCC。

图6 Western blot检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达

生物信息学分析确定CXCL8是miR-140-3p的直接靶标，miR-140-3p过表达抑制ESCC细胞中CXCL8表达。CXCL8是一种促炎趋化因子，可通过参与细胞凋亡抗性机制诱导肿瘤发生[18]。EMT可以改变肿瘤微环境，导致肿瘤-细胞迁移、增殖和免疫逃逸，CXCL8则可以通过激活多种信号通路，影响EMT相关转录因子，促进EMT[19]。研究发现，CXCL8在ESCC细胞中的高表达水平与淋巴结转移及预后不良密切相关[20]。与匹配的邻近组织相比，ESCC肿瘤组织中CXCL8阳性肿瘤细胞数量显着增加。CXCL8在ESCC肿瘤组织中的表达与肿瘤进展和生存率低呈正相关。原代ESCC细胞分泌的CXCL8可通过抑制自然杀伤细胞的功能，导致肿瘤免疫逃逸[21]。因此，针对CXCL8的免疫增强治疗策略可能有益于ESCC患者。本研究发现，CXCL8在EC109细胞中高表达，而miR-140-3p过表达降低了CXCL8蛋白水平，提示过表达miR-140-3p可能通过下调CXCL8来抑制EC109细胞恶性生物学行为。为了进一步证实该结论，我们在过表达miR-140-3p的基础上上调CXCL8的水平，结果发现，上调CXCL8逆转了过表达miR-140-3p抑制EC109细增殖、迁移、侵袭的作用。进一步证实该结论。

综上所述，miR-138-5p可能通过下调CXCL8来抑制EC109细胞EMT,抑制其迁移和侵袭能力，进而抑制EC109细胞的恶性进展。本文不足是未在体内进行研究，下步我们将在小鼠上验证miR-138-5p调节CXCL8对ESCC的影响。

文章来源:冯潇,张江浩,王博,等.miR-140-3p靶向CXCL8对食管鳞癌细胞增殖､侵袭和迁移能力的影响[J].实用癌症杂志,2024,39(12):1925-1931.