结直肠癌是消化系统常见恶性肿瘤，具有高发病率及高死亡率的特点，据调查显示，世界范围内每年有900万人遭受这种疾病，同时有80万人死亡，严重威胁人类的健康及生命[1]。因此，探寻一种新型、有效的治疗靶点，对结直肠癌早诊断、早治疗具有积极意义[2]。细胞增殖是机体维持内环境稳态的一个重要内在属性，其维持着各种器官细胞类型和细胞数目的相对恒定，故其一旦发生紊乱就会导致多种疾病的发生，且一直以来细胞过度增殖都被认为是癌症持续发展的主要原因，因此研究和揭示细胞增殖的相关调控机制是目前细胞生物学研究的主要方向和热点[3]。任何一种生命活动都离不开相应的物质和能量基础，肿瘤细胞也同样如此，其主要利用糖酵解为其生命活动提供能量，这一有别于正常细胞的现象被称为Warburg效应，在肿瘤细胞生长、转移和微环境的形成中发挥重要作用，因此了解结直肠癌中糖酵解的调控机制，对防治结直肠癌具有重要意义[4]。6-磷酸果糖激酶(PFK)-2是糖代谢的一种重要信号酶，广泛存在于各种生物细胞中，也是糖酵解的重要调节因子，故其在肿瘤的发生、发展中扮演重要角色[5]。目前治疗癌症的主要新兴手段有生物治疗、免疫治疗、基因治疗，其中基因治疗可最大限度杀伤癌细胞，保护正常细胞，得到广泛关注[6]。近年来，研究发现微小RNA(miR)与包括肿瘤在内的多种疾病均有着密切联系，可通过与靶基因相互作用，调控癌细胞增殖、凋亡，参与机体生理及病理过程，其中miR-103a-3P作为一种癌基因，在肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤中表达上调，且与患者不良预后密切相关[7]。但其在结直肠癌中的研究相对较少，本文旨在探讨miR-103a-3P调控PFK-2对结直肠癌细胞增殖及糖酵解的作用机制。

1、材料与方法

1.1 仪器

逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)仪(型号：7500,美国 Invitrogen公司);PowerPacTM基础电泳仪(型号：164-5051,美国 Bio-Rad公司);荧光倒置显微镜(型号：IX71-F22FL/PH,上海普赫有限公司)。

1.2 药物与试剂

NCM460正常结肠上皮细胞(货号：YS1996C,上海雅吉有限公司);WiDr结直肠癌细胞(货号：HTX2290C)及DiFi结直肠癌细胞(货号：HTX2448C);HCT116结直肠癌细胞(货号：YT800022)及脂质体2000(货号：YT1316,北京伊塔有限公司);SW480结直肠癌细胞(货号：A2655,上海酶研有限公司);Trizol试剂(货号：15596018)及葡萄糖摄取检测试剂盒(货号：UP02,上海研卉有限公司);cDNA 第一链合成试剂盒(货号：XY-TE-0738,沈阳万类有限公司);十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂盒(货号：KGP113,江苏凯基有限公司);RT-PCR 试剂盒(货号：RP1100)及质粒大量提取试剂盒(货号：D1130,北京索莱宝有限公司);5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU,货号：SC05790,北京凯诗源有限公司);乳酸检测试剂盒(货号：KTB1100-1,武汉亚科因有限公司)。

1.3 RT-PCR法检测mRNA相对表达

检测NCM460正常结肠上皮细胞和4种结直肠癌细胞系中的miR-103a-3P及PFK-2 mRNA表达，严格按照RT-PCR试剂盒步骤进行检测，分别取待检测细胞，加入1 ml Trizol 试剂，匀浆器充分匀浆以提取总RNA,提取完成后用电泳仪检测其完整性，用cDNA 第一链合成试剂盒进行逆转录合成 cDNA,然后利用RT-PCR仪，在95 ℃条件下预变性5 min, 94 ℃变性1 min, 58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 再延伸10 min, 40 ℃终止反应，此循环进行40次，收集miR-103a-3P及PFK-2荧光信号，反应结束后进行数据分析，以同一样本中U6的Ct值作为内参，采用2-ΔΔCt计算其基因相对表达量，引物序列(5′-3′):miR-103a-3P上游：CGCGAGCAGCATTGTACAGGG,下游：AG-TGCAGGGTCCGAGGTATT;PFK-2上游：GCUGU-GAAGCAGUACAGCUCCUAC,下游：GCCGCAUCGUGUACUACCUGAUGAA;U6上游：TGCG-GGTGCTCGCTTCGGCAGC,下游：CCAGTGCAGGG-TCCGAGGT。

1.4 实验分组

将HCT116结直肠癌细胞分为结直肠癌细胞(CC)组、结直肠癌细+miR-103a-3P-NC(MN)组，结直肠癌细胞+miR-103a-3P抑制剂(MI)组、结直肠癌细胞+miR-103a-3P激动剂(MM)组、结直肠癌细胞+PFK-2-NC(PN)组、结直肠癌细胞+PFK-2抑制剂(PI)组、结直肠癌细胞+PFK-2激动剂(PM)组、结直肠癌细胞+miR-103a-3P抑制剂+PFK-2抑制剂(MP)组。

1.5 细胞转染实验

取对数生长的HCT116细胞接种于6孔板内，细胞培养至80%～90%,将体积为4 μl脂质体和体积为200 μl缓冲液按照分组依次加入无菌的EP管中，混合均匀后温室条件下孵育10 min, 按照质粒大量提取试剂盒说明书，严格按步骤提取相关分组目的基因质粒DNA,提取完成后，分别取等量目的基因加入脂质体中配制成转染液，将细胞密度调整为1×105/ml后，常规培养24 h, 弃掉培养液，将转染液按分组依次加入孔板，并加入含10%胎牛血清的培养基使总体积到达1 ml, 各组细胞在37 ℃、5%CO2条件下培养24 h, 收集各组细胞用于后续实验。

1.6 细胞增殖实验

取转染后的各组细胞进行消化、离心，弃掉上清液后重悬细胞，将其接种于96孔板中，调整密度为4×104个/100 μl, 在37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养，等细胞贴壁后，向其中加入100 μl 50 μmol/L完全培养基稀释的EdU(1 000∶1),在37 ℃下培育2 h, 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，加入100 μl 4%多聚甲醛室温固定30 min, 清除多于固定液后，对细胞进行通透处理，室温通透20 min后，进行EdU染色30 mim, PBS洗涤3次，用Hoechst染色液进行DNA染色，染色完成后，除去多于染色液，立即置于倒置荧光显微镜下拍照观察。

1.7 细胞糖酵解实验

取转染后的各组细胞进行消化、离心，弃掉上清液后重悬细胞，将其接种于6孔板中，调整密度为1×105个/100 μl, 在37 ℃、5%CO2的培养箱中进行培养，等细胞贴壁后，分别用葡萄糖摄取检测试剂盒和乳酸检测试剂盒检测各组葡萄糖摄取量及乳酸含量，实验步骤应严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.8 双荧光素酶报告基因检测

用生物信息学方法分析并预测PFK-2的 3′非翻译区(UTR)区能识别 miR-103a-3p 种子序列的结合位点，然后利用点突变技术扩增出含有Hind Ⅲ和 SpeⅠ酶切位点的PFK-2突变位点3′UTR,分别将野生型和突变型PFK-2 3′UTR插入到海肾荧光素酶报告基因质粒中，鉴定并提纯后，然后取结直肠癌细胞将其接种于6孔板中，参照转染试剂说明书将构建好的PFK-2-3′-UTR-WT和PFK-2-3′-UTR-MUT质粒分别与miR-103a-3P-NC和miR-103a-3P共转染至细胞，转染48 h后，严格按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测操作步骤检测各组细胞荧光素酶活性。

1.9 统计学分析

采用GraphPad Prism8.0软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。

2、结果

2.1 NCM460和4种结直肠癌细胞系中miR-103a-3P及PFK-2mRNA表达

结直肠癌细胞系中miR-103a-3P、PFK-2 mRNA表达量显著高于正常结直肠癌上皮细胞系NCM460(P<0.05),其中HCT116 miR-103a-3P、PFK-2 mRNA升高最大，因此选取其作为此次实验细胞。见表1。

2.2 双荧光素酶报告检测结果

转染miR-103a-3P后可显著促进PFK-2-3′-UTR-WT的荧光素酶活性(P<0.05),但对突变基因无显著影响(P>0.05),且PFK-2与miR-103a-3P呈正相关(r=0.933,P<0.001)。见表2、图1、图2。

表1 NCM460和四种结直肠癌细胞系中miR-103a-3P及PFK-2 mRNA的表达

表2 双荧光素酶报告

图1 miR-103a-3P与PFK-2靶向结合靶点   

图2 miR-103a-3P mRNA相对表达量与PFK-2 mRNA 相对表达量相关性   

2.3 各组结直肠癌细胞增殖及糖酵解比较

与CC组相比，MN组及PN组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量无统计学差异(P>0.05);MI组、PI组、MP组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量明显降低(P<0.05)。与MN组相比，MM组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量明显升高(P<0.05)。与MM组相比，MI组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量明显降低(P<0.05)。与PN组相比，PM组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量明显升高(P<0.05)。与PM组相比，PI组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量明显降低(P<0.05)。与PI组相比，MI组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量无统计学差异(P>0.05);MP组细胞增殖及葡萄糖摄取水平、乳酸含量明显降低(P<0.05)。见表3、图3。

表3 各组结直肠癌细胞增殖及糖酵解比较

图3 各组细胞增殖(×200)  

3、讨论

结直肠癌已经成为我国患病率、死亡率最高的疾病之一，且每年的增长速度约为世界平均水平的两倍[8]。结直肠癌的发生、发展是一个多基因、多步骤的复杂过程，其早期病情隐匿，多数患者就诊时已到晚期，甚至是发生转移，导致患者的生存率极大降低，且预后并不理想，因此探寻一种有效的治疗手段显得尤为重要[9]。miRNA是一种广泛存在于生物体内的一种内源性非编码单链小分子，其可通过多种方式调控下游靶基因，进而参与细胞凋亡、增殖等多种生物学活动，且研究表明，其表达异常与结直肠癌的发生密切相关，而miR-103a-3P是miRNA的一种，其在癌细胞转移、侵袭及凋亡等方面发挥着重要作用[10]。PFK-2是糖酵解途径中的关键酶，其可通过调节果糖-6-磷酸表达进而调控细胞内的糖酵解水平，从而为肿瘤细胞的生长提供有利的营养条件，因此如何抑制PFK-2表达已经成为目前医学领域研究的热点之一[11]。结直肠癌中miR-103a-3P表达升高，可能是因为结直肠癌中Dicer酶升高，从而导致其与下游靶基因结合不完全，进而大量聚集于体内，而对于PFK-2表达升高，可能是因为肿瘤微环境被炎性反应，氧化应激等活化，从而促进肿瘤细胞糖酵解，进而激活PFK-2,使其大量转录。本研究结果表明，miR-103a-3P、PFK-2可能参与癌症进程。Sun等[12]研究表明，miR-103a-3p在结直肠癌细胞中高表达，通过靶向Hippo/YAP1通路的核心分子肿瘤抑制激酶(LATS)2和人同源重组蛋白(SAV)1促进低氧诱导因子(HIF)1A表达，促进结直肠癌细胞增殖、糖酵解，这与本文结果类似。

结直肠癌最本质也是最重要的生物学特征之一是肿瘤细胞的过度增殖[13]。肿瘤细胞为满足自身快速增殖和侵袭转移的能量需要，必须重新调节自身能量代谢状态，这一过程被称为代谢重编程，其中又优先采用糖酵解途径作为其能量来源，采用糖酵解的细胞代谢方式通常显示出葡萄糖摄取及乳酸产生增加的特征，故葡萄糖摄取水平及乳酸含量可作为反映糖酵解水平的有效指标[14]。而对于结直肠癌细胞，抑制miR-103a-3P可使其基因组稳定性到达恢复，使其不易发生变异，从而有效调控下游靶基因、改善肿瘤细胞自身代谢异常情况，进而抑制肿瘤细胞能够产生自我增殖信号、抑制糖酵解途径，最终到达抑制细胞增殖，改善细胞糖酵解的目的。研究发现[15],抑制miR-103a-3P可显著抑制结直肠癌细胞增殖。侵袭及迁移，并可有效抑制细胞糖酵解，这与本文结果类似。

本研究双荧光素酶报告结果说明，PFK-2可能是miR-103a-3P的靶基因。通过生物信息学分析发现PFK-2是miR-103a-3P的靶基因可能性较大[16]。在结直肠癌中PFK-2呈现高表达，但miR-103a-3P通过其调控结直肠癌的作用机制尚无相关研究[17]。miR-103a-3P可显著促进PFK-2活性，猜测可能是由于miR-103a-3P通过与PFK-2进行完全或不完全互补配对，来影响其mRNA转录水平，进而对其蛋白编码基因翻译进行调控，正调节PFK-2表达，最终达到调控细胞增殖及糖酵解的目的。Zhang等[18]研究表明，miR-103a-3p抑制通过调控钙调磷酸酶调节蛋白(RCAN)1抑制口腔鳞癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，这说明其可能成为新的诊断标志物和治疗靶点，这与本文结果类似。本文为治疗结直肠癌的科学研究提供了提供新的途径和策略，有望成为结直肠癌治疗的新靶点。但本实验仍存在一定不足，由于实验室水平有限，尚未建立miR-103a-3P慢病毒对大鼠的干预，在今后的实验中会进一步添加miR-103a-3P对结直肠癌的参考依据。

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[6]张辉,路明亮.miR-124在结直肠癌的相关研究进展:一个潜在的治疗靶点[J].实用医学杂志,2021;37(13):1774-8.

[8]曹玉娟,赵聪,姚艳红,等.西妥昔单抗联合化疗治疗KRAS基因野生型晚期结直肠癌伴肝转移患者临床效果观察及预后影响因素分析[J].临床军医杂志,2021;49(8):883-6.

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[11]魏莱.6-磷酸果糖-2-激酶在结直肠癌中的表达､临床意义及作用[D].重庆:第三军医大学,2017.

[13]李志发,罗超元,吴小兵,等.三叶青乙酸乙酯提取物通过miR-515-5p/CDCA5调控结直肠癌细胞HCT116增殖､迁移及侵袭[J].中国免疫学杂志,2021;37(24):2970-1,2985.

[14]王艺璇.miR-485-5p/NQO1信号轴介导有氧糖酵解调控结直肠癌恶性演进的机制研究[D].延吉:延边大学,2021.

[15]张秋阁.非编码RNA miR-103a-3p调控结直肠癌细胞糖酵解途径和生物学功能的研究[D].郑州:郑州大学,2020.

[16]李姗姗,裴阳,张威,等.miR-429靶向调控SIAH1基因对结直肠癌细胞LOVO增殖的影响[J].中国癌症防治杂志,2021;13(5):506-11.

[17]魏莱,王喆,梁后杰.6-磷酸果糖-2-激酶在结直肠癌中的表达及临床意义[J].第三军医大学学报,2017;39(10):983-9.

基金资助:河南省医学科技攻关计划省部共建项目(No.SBGJ202002058);

文章来源:冯盼盼,王恒,王晓霞.miR-103a-3P调控PFK-2对结直肠癌细胞增殖及糖酵解的作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(02):454-459.