结直肠癌(CRC)是最常见的癌症类型之一，高复发转移率是晚期CRC患者的主要死亡原因[1]。尽管近年来对于CRC的治疗方法有所改进，但约有50%CRC患者在治疗后仍会出现肿瘤转移或复发，这导致总体生存率较差[2]。因此，阐明CRC增殖和转移的潜在机制对于改善CRC患者的治疗和预后具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是包含22个核苷酸的非编码RNA,其已被证明与肿瘤的发生发展密切相关[3]。miR-520f-3p被认为可以抑制肺癌[4]、肝癌[5]等多种肿瘤细胞的生长。而miR-520f-3p对CRC的影响尚不清楚。层黏连蛋白(LAMA)3是一种在各种肿瘤中被广泛研究的基因，研究显示，LAMA3在胰腺癌组织中高表达，且可促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移[6]。本研究通过生物信息学预测发现miR-520f-3p与LAMA3存在结合位点，而miR-520f-3p能否靶向LAMA3调控CRC细胞增殖、迁移尚不明确。关于LAMA3在CRC中具有何种效应鲜有报道。因此，本研究主要探究miR-520f-3p对CRC细胞增殖、迁移的影响及其作用的分子机制。

1、材料与方法

1.1 临床标本收集

收集2018年2月至2021年12月在福建医科大学附属龙岩第一医院首次确诊为CRC的41例患者的癌组织及距离癌组织3 cm处癌旁组织。所有患者未接受任何形式的治疗，并签署了知情同意书。该研究得到医院伦理委员会的批准。

1.2 细胞

正常结直肠细胞FHC及CRC细胞SW480、LOVO、HCT116、HT29均购自中国科学院上海细胞库。

1.3 动物

35只SPF级BALB/c雄性裸鼠购自长春卓谊生物股份有限公司，4～6周龄，体质量15 g左右，生产许可证号SCXK(吉)2019-0004,动物使用许可证号SYXK(吉)2020-0005,大鼠饲养于福建医科大学附属龙岩第一医院动物房，所有大鼠饲养于正常12 h明暗交替环境中1 w, 期间可自由饮水采食，实验前禁食12 h, 本研究得到医院动物伦理委员会的批准(伦理批号：20211023),所有动物实验遵循3R原则。

1.4 主要试剂与仪器

miR-520f-3p模拟物(miR-520f-3p mimics)及其阴性对照(mimics NC)、miR-520f-3p抑制物(miR-520f-3p inhibitor)及其阴性对照(inhibitor NC)、LAMA3过表达质粒(pcDNA-LAMA3)及其阴性对照(pcDNA)均购自厦门慧嘉生物科技有限公司；DMEM培养基(批号：20200806)购自上海中乔新舟生物科技有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂(批号：20200817)购自北京宜科思源科技有限公司；miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(批号：20200909)购自上海钰博生物科技有限公司；miRcute miRNA q聚合酶链反应(PCR)检测试剂盒(批号：20201106)购自天根生化科技(北京)有限公司；兔源一抗LAMA3(批号：20201213)、增殖细胞核抗原(PCNA,批号：20201125)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1(批号：20200918)、基质金属蛋白酶(MMP)-2(批号：20200913)、GAPDH(批号：20201011)及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(批号：20201018)均购自Abcam公司；CCK-8试剂盒(批号：20201114)购自北京康瑞纳生物科技有限公司；ABI7500 荧光定量PCR仪(批号：4351105)购自广州柏赛柯生物公司；Lonza酶标仪(批号：25-315S)购自北京泽平科技公司。

1.5 细胞培养与转染

将FHC、SW480、LOVO、HCT116、HT29细胞在含有10%胎牛血清的DMEM中培养，培养条件为37 ℃、5%CO2。取对数生长期的LOVO细胞，利用LipofectamineTM2000转染试剂进行转染，并分为对照组(未转染的LOVO细胞)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC)、miR-520f-3p inhibitor组(转染miR-520f-3p inhibitor)、mimics NC组(转染mimics NC)、miR-520f-3p mimics组(转染miR-520f-3p mimics)、miR-520f-3p mimics+pcDNA组(miR-520f-3p mimics和pcDNA共转染)、miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3组(miR-520f-3p mimics和pcDNA-LAMA3共转染)。转染48 h后，利用实时荧光定量(qRT)-PCR、Western印迹分别检测各组细胞中miR-520f-3p、LAMA3蛋白表达。

1.6 qRT-PCR检测组织和细胞中miR-520f-3p表达

利用TRIzol试剂提取组织和细胞中的总RNA,使用miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis试剂盒将总RNA逆转录为cDNA,通过miRcute miRNA qPCR检测试剂盒进行PCR,以U6为内参，按照2-ΔΔCt法计算miR-520f-3p表达。引物序列：U6正向：5'-GACCGAGTGTAGCAAGG-3',反向：5'-GTTCTTCCGAGAACATATAC-3';miR-520f-3p正向：5'-GTGCCTGTTGCGTCTC-3',反向：5'-GAAAGCCTAGCCGTATTCG-3'。

1.7 CKK-8法检测细胞增殖

将各组细胞以1×104个/孔的密度接种在96孔板中，然后在37 ℃、5%CO2下孵育。分别在细胞孵育的0、24、48 h时，向每孔中加入10 μl CCK-8溶液。孵育1 h后，使用酶标仪检测450 nm处的光密度(OD)值以评估细胞增殖能力。

1.8 划痕实验检测细胞迁移

将各组细胞接种至12孔板中，细胞密度为2×105个/孔。当细胞生长汇合到85%左右时，利用200 μl移液器枪头垂直12孔板底部进行划痕。经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次后，将细胞在不含胎牛血清的DMEM培养基中培养。通过显微镜观察并拍照0、48 h的划痕。划痕愈合率(%)=(1-48 h划痕距离/0 h划痕距离)×100%。

1.9 Western印迹检测细胞中LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表达

用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白质浓度，将等量的蛋白质经电泳、转膜、封闭后，将膜与一抗LAMA3(1∶2 000)、PCNA(1∶1 000)、CyclinD1(1∶2 000)、MMP-2(1∶1 000)、GAPDH(1∶1 000)在4 ℃的摇床上孵育过夜。然后加入HRP标记的山羊抗兔二抗在37 ℃下孵育2 h, 加入电化学发光(ECL)观察蛋白显色情况，通过ImageJ软件评估蛋白的灰度值。

1.10 双荧光素酶报告基因实验

分别构建LAMA3野生型质粒(WT-LAMA3)及突变型质粒(MUT-LAMA3),利用LipofectamineTM2000转染试剂将WT-LAMA3和MUT-LAMA3分别与mimics NC或miR-520f-3p mimics共转染于LOVO细胞，48 h后，检测荧光素酶活性。

1.11 裸鼠体内成瘤实验

将1.5中的各组细胞(1×106个)分别注射到裸鼠左侧腋窝皮下，分别为对照组、inhibitor NC组、miR-520f-3p inhibitor组、mimics NC组、miR-520f-3p mimics组、miR-520f-3p mimics组、miR-520f-3p mimics+pcDNA组、miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3组，每组5只，注射3 w后，处死裸鼠并收集肿瘤，称量并记录肿瘤质量。

1.12 统计学方法

采用GraphPad Prism5软件进行t检验、单因素方差分析及SNK-q检验。

2、结果

2.1 miR-520f-3p、LAMA3蛋白在CRC组织中的表达

与癌旁组织比较，CRC组织中miR-520f-3p水平显著降低，LAMA3蛋白水平显著升高(P<0.05),见图1和表1。

图1 Western印迹检测组织中LAMA3蛋白表达   

表1 miR-520f-3p在CRC和癌旁组织中表达

2.2 miR-520f-3p在不同细胞系中的表达

与正常结直肠细胞FHC(1.00±0.00)比较，CRC细胞SW480、LOVO、HCT116、HT29中miR-520f-3p表达水平(0.28±0.02、0.22±0.01、0.44±0.02、0.56±0.04)显著降低(均P<0.05),且miR-520f-3p在LOVO细胞中的表达最低，因此，后续以LOVO细胞为研究对象。

2.3 各组LOVO细胞中miR-520f-3p表达比较

与对照组(1.00±0.00)、inhibitor NC组(1.02±0.11)比较，miR-520f-3p inhibitor组miR-520f-3p表达水平(0.22±0.01)显著降低(均P<0.05);与对照组、mimics NC组(1.03±0.12)比较，miR-520f-3p mimics组miR-520f-3p表达水平(2.69±0.21)显著升高(P<0.05);与miR-520f-3p mimics组、miR-520f-3p mimics+pcDNA组(2.71±0.23)比较，miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3组miR-520f-3p表达水平(2.72±0.22)变化差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组LOVO细胞增殖能力比较

与对照组、inhibitor NC组比较，miR-520f-3p inhibitor组细胞在24、48 h的OD450值显著升高(P<0.05);与对照组、mimics NC组比较，miR-520f-3p mimics组细胞在24、48 h的OD450值显著降低(P<0.05);与miR-520f-3p mimics组、miR-520f-3p mimics+pcDNA组比较，miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3组细胞在24、48 h的OD450值显著升高(P<0.05),见表2。

2.5 各组细胞迁移能力比较

与对照组、inhibitor NC组比较，miR-520f-3p inhibitor组细胞划痕愈合率显著升高(P<0.05);与对照组、mimics NC组比较，miR-520f-3p mimics组细胞划痕愈合率显著降低(P<0.05);与miR-520f-3p mimics组、miR-520f-3p mimics+pcDNA组比较，miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3组细胞划痕愈合率显著升高(P<0.05),见表3、图2。

表2 各组细胞增殖能力比较

表3 各组细胞划痕愈合率及LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表达比较

2.6 各组细胞中LAMA3、增殖、迁移相关蛋白表达比较

与对照组、inhibitor NC组比较，miR-520f-3p inhibitor组LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表达显著升高(P<0.05);与对照组、mimics NC组比较，miR-520f-3p mimics组细胞中LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表达显著降低(P<0.05);与miR-520f-3p mimics组、miR-520f-3p mimics+pcDNA组比较，miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3组细胞中LAMA3、PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表达显著升高(P<0.05),见表3、图3。

图2 划痕实验检测各组细胞迁移(×40)  

2.7 miR-520f-3p靶向调控LAMA3

通过Targetscan预测miR-520f-3p与LAMA3的结合位点，见图4。双荧光素酶报告基因检测结果显示，与mimics NC和WT-LAMA3共转染组比较，miR-520f-3p mimics和WT-LAMA3共转染组细胞荧光素酶活性明显降低(P<0.05);与mimics NC和MUT-LAMA3共转染组比较，miR-520f-3p mimics和MUT-LAMA3共转染组细胞荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05),见表4。

图3 Western印迹检测细胞中LAMA3、 PCNA、CyclinD1、MMP-2蛋白表达   

图4 Targetscan预测miR-520f-3p与LAMA3的结合位点   

表4 荧光素酶活性比较

2.8 各组裸鼠体内移植瘤比较

与对照组[(0.79±0.06)g]、inhibitor NC组[(0.80±0.07)g]比较，miR-520f-3p inhibitor组肿瘤质量[(1.06±0.11)g]显著升高(P<0.05);与对照组、mimics NC组[(0.81±0.07)g]比较，miR-520f-3p mimics组肿瘤质量[(0.34±0.02)g]显著降低(P<0.05);与miR-520f-3p mimics组、miR-520f-3p mimics+pcDNA组[(0.36±0.03)g]比较，miR-520f-3p mimics+pcDNA-LAMA3组肿瘤质量[(0.63±0.05)g]显著升高(P<0.05),见图5。

图5 各组裸鼠体内移植瘤比较

3、讨论

CRC是全球第三大最常见癌症，2018年报告的新病例超过184万，仅次于肺癌和乳腺癌[7,8]。据统计，CRC患者的高死亡率和不良预后主要与肿瘤细胞的高转移率有关，转移患者的生存率低于10%[9]。因此，探究CRC细胞增殖、转移的分子机制对于提高CRC患者的生存率具有重要意义。

miRNA失调导致靶基因异常表达，并与癌症发展有关[10]。miR-520f-3p的失调已在多种肿瘤中被报道。如miR-520f-3p在胆管癌细胞中低表达，敲低miR-520f-3p可促进细胞增殖、迁移和侵袭[11];过表达miR-520f-3p可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[12];下调miR-520f-3p促进了胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭[13]。本研究结果与其一致。PCNA、CyclinD1是与细胞增殖相关的因子[14],而MMP-2是常被用于衡量细胞迁移能力强弱的重要指标[15]。本研究结果提示，在体外水平上过表达miR-520f-3p可显著抑制LOVO细胞增殖、迁移，而少量的miR-520f-3p(即沉默miR-520f-3p)则不能起到抑制LOVO细胞增殖、迁移的作用，因此表现出促进LOVO细胞增殖、迁移的作用；表明过表达miR-520f-3p可抑制CRC细胞增殖、迁移及体内肿瘤生长。

本研究通过生物信息学预测及双荧光素酶报告基因实验证实LAMA3为miR-520f-3p的靶基因。LAMA3是细胞外基质糖蛋白家族中的成员，也是基底膜中的主要非胶原成分，其与细胞黏附、分化、迁移、信号传导等多种生物过程有关[16]。据报道，LAMA3在胰腺癌组织中表达上调，其表达情况与患者的肿瘤大小、TNM分期显著相关[17];LAMA3在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织[18];LAMA3在喉鳞状细胞癌中具有促进肿瘤进展的作用[19]。通过本研究结果推测过表达miR-520f-3p可能通过下调LAMA3抑制CRC细胞增殖、迁移及体内肿瘤生长。本研究结果提示，上调LAMA3可减弱过表达miR-520f-3p对CRC细胞增殖、迁移抑制，也逆转了对裸鼠体内肿瘤生长的抑制，表明过表达miR-520f-3p通过下调LAMA3抑制CRC细胞增殖、迁移。本研究为CRC进展新分子机制的研究提供参考，这可能为阻止CRC转移提供一种新的治疗策略。

参考文献:

[6]王维杰,赵森峰,曹家辉,等.LAMA3在胰腺癌中的预后价值及机制的生物信息学分析[J].肝胆胰外科杂志,2021;33(9):533-8.

[11]关沧海,刘浪,史武江,等.LncRNA SNHG20通过miR-520f-3p调控胆管癌细胞增殖和侵袭[J].中国癌症防治杂志,2021;13(4):389-94.

[17]李晨,宋洪亮,俞海波,等.LAMA3在胰腺癌中的表达及其临床意义[J].肝胆胰外科杂志,2021;33(2):85-88,95.

[18]王艳梅,赵博慧,陈坤,等.诱导特异性CD8+T细胞产生的肝细胞癌相关新抗原分析[J].中华肿瘤杂志,2019;41(6):429-34.

基金资助:福建医科大学启航基金(No.2020QH1331);

文章来源:苏雪梅,钟平玉,孙银平.miR-520f-3p靶向LAMA3对结直肠癌细胞增殖､迁移的影响[J].中国老年学杂志,2024,44(02):475-480.