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甲状腺癌组织中Apelin及Snail蛋白的临床意义

2020-10-14 214 上传者：管理员

摘要：目的：探讨甲状腺癌组织中Apelin及Snail蛋白的表达水平及临床意义。方法：选取2006年4月至2009年4月广东省惠州市第六人民医院收集的甲状腺癌组织标本118例、甲状腺良性疾病标本80例、正常甲状腺组织标本50例为研究对象，分为甲状腺癌组、甲状腺良性组和正常组。采用SP免疫组化方法检测各组Apelin及Snail蛋白表达情况（以光密度表示），分析Apelin、Snail蛋白的相关性及二者与甲状腺癌病理表现、预后的关系。结果：甲状腺癌组Apelin和Snail蛋白表达水平均高于甲状腺良性组和正常组（P<0.05），且Apelin与Snail蛋白表达呈正相关关系（P<0.05）。Apelin蛋白与侵犯包膜、肿瘤直径、hMVD有关（P<0.05),Snail蛋白表达与侵犯包膜、TNM分期、淋巴结转移者有关（P<0.05);Apelin<3.53组10年生存率为95.37%,Apelin≥3.53组10年生存率为80.02%，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（P<0.05）。Snail<3.10组10年生存率为92.38%,Snail≥3.10组10年生存率为81.28%，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（P<0.05）；经单因素和多因素分析，TNM分期、淋巴结转移、hMVD高密度、Apelin≥3.53、Snail≥3.10是影响甲状腺癌预后的危险因素（P<0.05）。结论：甲状腺癌组织中Apelin和Snail蛋白均上调表达，二者表达呈正相关关系，且通过不同机制参与甲状腺癌发生发展，并与甲状腺癌预后相关。

关键词：
apelin
Snail
危险因素
甲状腺癌
病理表现
肿瘤直径
预后
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甲状腺癌是一种易复发、易转移的内分泌系统恶性肿瘤，起源于甲状腺上皮细胞癌变，占全身恶性肿瘤的1%左右。发病机制尚不明确，可能与原癌基因突变、缺碘、电离辐射、遗传等因素有关[1]。尽早发现、诊断并有效治疗是改善甲状腺患者预后，提高患者生活质量的关键所在[2]。许多肿瘤的发生发展依赖于血管新生，而Apelin作为一种新的血管生成因子，在血管内皮细胞增殖、迁移过程中起到促进作用[3]。有研究显示，与正常肺组织相比，肺癌组织中Apelin的表达水平明显较高，且与肺癌预后密切相关[4]，但关于Apelin表达水平与甲状腺癌的关系，国内尚未见报道。上皮细胞-间质转化是指上皮细胞极性丧失，获得间质特性，存在于肿瘤发生发展过程中，参与肿瘤侵袭、转移。转录因子Snail可通过下调E-cadherin表达，促进EMT发生[5]。有研究显示，Snail蛋白在预测胃癌侵袭转移方面具有重要意义[6]，但与甲状腺癌是否有关，国内研究较少。鉴于此，本研究通过检测甲状腺癌组织Apelin和Snail蛋白表达水平，明确二者的关系，并探讨其与甲状腺癌新生血管形成及癌细胞浸润、转移的关系。

1、资料与方法

1.1一般资料

选取2006年4月至2009年4月广东省惠州市第六人民医院收集的甲状腺癌组织标本118例、甲状腺良性疾病标本80例、正常甲状腺组织标本50例为研究对象，分为甲状腺癌组、甲状腺良性组和正常组。病例纳入标准：（1）甲状腺癌标本来源于本院经手术治疗的患者，甲状腺良性疾病标本及正常甲状腺标本来源于病理活检或手术后患者，均经病理证实；（2）甲状腺癌患者术前均进行放、化疗。排除合并其他恶性肿瘤者。组织标本的获取和使用均获得本院伦理委员会批准同意。

1.2主要试剂

鼠抗人Apelin单克隆抗体购自上海莼试生物技术有限公司；兔抗人Snail多克隆抗体购自武汉博欧特生物科技有限公司；兔抗人CD34多克隆抗体购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司；SP免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒均购自上海恒斐生物科技有限公司。

1.3免疫组化方法

采用免疫组化SP法分别检测甲状腺癌组织、甲状腺良性病变组织、正常甲状腺组织标本Apelin、Snail、CD34蛋白表达情况，采用全自动免疫组织化学仪检测，遵循实验步骤说明书进行。中性甲醛固定标本，常规脱水、石蜡包埋、切片，石蜡切片控制在4μm左右，37℃烤箱放置过夜，二甲苯脱蜡2次，PBS清洗3次，梯度酒精水化，0.3%过氧化氢灭活10min,PBS清洗3次，抗原修复10min,PBS清洗3次，加入一抗低温孵育过夜，用已知阳性组织作为阳性对照，反复洗涤后，生物素化标记的二抗孵育1h。PBS清洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素孵育0.5h，最后采用DAB显色，细胞核采用苏木精复染。

1.4图像处理

采用显微镜对所有切片拍照，通过计算机图像分析系统测定光密度以反映Apelin、Snail蛋白表达情况，采用CD34抗体标记甲状腺癌中的微血管，先于100倍镜下确定血管密度最高处，然后于200倍镜下随机选取5个视野对染色血管进行计数，即血管密度最高处血管密度（hotspotMVD,hMVD）。本研究118例甲状腺癌组织hMVD范围为10～58，中位数为23，所以将hMVD<23视作hMVD低密度，hMVD≥23视作hMVD高密度。

1.5统计学方法

采用SPSS21.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验；计量数据如符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验；Apelin与Snail蛋白表达的关系采用Pearson相关性分析；生存分析采用KaplanMerier分析，组间比较采用Log-rank检验；预后影响因素分析采用Cox比例风险回归模型。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组一般资料比较

两组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。此外，甲状腺癌组患者中乳头状癌71例、滤泡癌23例、髓样癌8例，未分化癌16，侵犯包膜43例，平均肿瘤直径（2.87±0.66)cm,TNM分期:Ⅰ期36例，Ⅱ期56例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例，伴有淋巴结转移56例。甲状腺良性组中结节性甲状腺肿43例，甲状腺腺瘤37例。

2.2各组Apelin、Snail蛋白表达情况及二者相关性

甲状腺癌组Apelin和Snail蛋白表达水平均高于甲状腺良性组和正常组（P<0.05），见表2;Apelin和Snail蛋白均表达于细胞核或细胞质中，呈黄棕色，见图1;Pearson相关性分析显示，Apelin与Snail蛋白表达呈正相关关系（r=0.461,P<0.05）。

表1各组一般资料

表2两组Apelin和Snail蛋白表达水平

与甲状腺良性组比较，*P<0.05，与正常组比较，#P<0.05。

图1不同甲状腺组织中Apelin及Snail蛋白表达情况（SP法，200×）

A：甲状腺癌组织中Apelin呈阴性表达；B：甲状腺癌组织中Apelin呈阳性表达；C：甲状腺癌组织中Snail呈阴性表达；D：甲状腺癌组织中Snail呈阳性表达；E：甲状腺良性疾病组织中Apelin阴性表达；F：甲状腺良性疾病组织中Snail阴性表达；G：正常甲状腺组织中Apelin阴性表达；H：正常甲状腺组织中Snail阴性表达。

2.3Apelin及Snail蛋白表达与甲状腺癌临床特征关系

侵犯包膜者、肿瘤直径≥4cm者、hMVD高密度者Apelin蛋白表达水平均高于无侵犯包膜者、肿瘤直径<4cm者、hMVD低密度者（P<0.05）。侵犯包膜者、TNM分期Ⅲ期+Ⅳ期者、淋巴结转移者Snail蛋白表达水平均高于无侵犯包膜者、TNM分期Ⅰ期+Ⅱ期者、无淋巴结转移者（P<0.05），见表3。

2.4Apelin及Snail蛋白表达对甲状腺癌预后的影响

所有患者均随访1～10年，参考文献[7]的方法以甲状腺癌Apelin蛋白表达中位水平3.53作为分界点，Apelin<3.53组10年生存率为95.37%,Apelin≥3.53组10年生存率为80.02%，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（P<0.05）。同上，以甲状腺癌Snail蛋白表达中位水平3.10作为分界点，Snail<3.10组10年生存率为92.38%,Snail≥3.10组10年生存率为81.28%，两组生存曲线比较，差异有统计学意义（P<0.05），见图2和图3。

2.5甲状腺癌预后的COX单因素与多因素分析

对各项资料进行单因素Cox比例风险回归模型分析，显示年龄、性别、病理类型、侵犯包膜情况、肿瘤直径不影响预后（P>0.05），而TNM分期、淋巴结转移、hMVD高密度及Apelin、Snail表达影响预后（P<0.05）；将单因素分析入选方程因素进行多因素Cox比例风险回归分析，显示进入模型的变量分别是TNM分期、淋巴结转移、hMVD高密度、Apelin≥3.53、Snail≥3.10，提示其是甲状腺癌患者预后的影响因素（P<0.05），见表4。

表3Apelin及Snail蛋白表达与甲状腺癌临床特征关系

图2Apelin蛋白表达对甲状腺癌生存期的影响

图3Snail蛋白表达对甲状腺癌生存期的影响

表4甲状腺癌预后的COX单因素与多因素分析

3、讨论

新生血管在肿瘤生长和转移过程中起到重要作用，故肿瘤治疗的重要方法之一是抑制新生血管生成。抗血管内皮生长因子制剂如贝伐单抗已被批准用于乳腺癌、肺癌、直肠癌等肿瘤治疗，这提示肿瘤治疗采用抗血管生成的靶向治疗是可行的[8]。而Apelin作为一种新的血管生成因子，同样具有促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管发生的作用，且Apelin抑制剂可有效抑制血管发生[9]。有研究以消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌、妇科肿瘤、前列腺癌等多种肿瘤的患者和健康者为研究对象，发现相对于健康者，肿瘤患者血清Apelin水平显著较高，但与肿瘤转移和分期无明显关系[10]。另有研究显示，肝癌组织中Apelin表达水平明显高于正常肝组织，且Apelin高表达肝癌患者5年生存率明显低于Apelin低表达肝癌患者[11]。上述研究均提示高表达Apelin与恶性肿瘤发生发展密切相关，本研究结果显示，甲状腺癌组Apelin蛋白表达水平显著高于甲状腺良性组和正常组，且与侵犯包膜、肿瘤直径和hM-VD病理表现有关（P<0.05），提示Apelin参与甲状腺癌的发生发展，与在其他恶性肿瘤上的研究结果相似。而在预后方面，本研究发现Apelin≥3.53组10年生存率低于Apelin<3.53组，且Apelin≥3.53是影响预后的独立危险因素（P<0.05）。本研究推测Apelin可能通过促进甲状腺肿瘤血管生成，使肿瘤微环境有较为充足的血液供应，从而起到促进肿瘤生长作用，不利于患者预后，但其确切机制需进一步论证。

Snail属于锌指转录因子家族，参与多种生物的中胚层形成、神经分化等过程，除此之外还在EMT形成过程中起到重要作用。EMT是一种能使上皮细胞分离于上皮组织，并向其他部位迁移的生物机制，不仅是正常发育的基础，同时也是恶性上皮肿瘤发生的基础[12]。有动物研究显示，皮肤癌小鼠的侵袭前角细胞Snail蛋白表达上调[13]。临床研究显示，人类胃癌、结肠癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤组织中Snail蛋白呈高表达状态，且Snail表达水平与乳腺癌淋巴结转移有关[14]。近期，有基础研究发现，Snail可能与甲状腺癌有关，但临床研究尚缺少报道[15]。本研究结果显示，甲状腺癌组Snail蛋白表达水平显著高于甲状腺良性组和正常组，其与侵犯包膜、TNM分期、淋巴结转移等病理表现密切相关（P<0.05），提示Snail参与甲状腺癌的发生发展，与在其他恶性肿瘤上的研究结果相似。同时，有研究指出，Apelin可激活人肾小管上皮细胞PKC-ε，激活SMAD信号通路，诱导肾小管上皮细胞EMT转化[16]。基于上述Snail与EMT的分析，推测Apelin与Snail可能通过共同信号通路相互作用，参与甲状腺癌EMT过程。事实上，本研究Pearson相关性分析发现Apelin与Snail蛋白表达呈正相关关系（P<0.05），初步证实了上述推测，但EMT与肿瘤侵袭转移之间存在着复杂调控机制，可能还与其他许多信号分子有关。在预后方面，本研究发现，Snail≥3.10组10年生存率低于Snail<3.10组，且Apelin≥3.10是影响预后的危险因素（P<0.05）。分析原因，EMT表现为E-cadherin等蛋白标记的丢失，E-cadherin黏附性受损或降低使原发病灶处的癌细胞易于脱离，增强癌细胞侵袭转移能力。而Snail蛋白可对EMT进行调控，通过抑制甲状腺癌细胞E-cadherin表达起到促EMT发生作用，对预后产生不利影响。

综上所述，Apelin可通过促进新生血管形成参与甲状腺癌发生发展，Snail通过促进EMT发生参与甲状腺癌发生发展，Apelin或Snail表达与甲状腺癌预后密切相关，可能成为甲状腺癌诊疗、预后评估的重要潜在指标。

参考文献：

[7]宋然.表皮生长因子受体—酪氨酸激酶抑制剂对老年非小细胞肺癌患者的效果[J].中国老年学,2017,37(18):4556-4557.

郭朝晖,戴玉容,谢宁,李泽伟,叶国强.甲状腺癌组织中Apelin及Snail蛋白的表达水平及临床意义[J].广西医科大学学报,2020,37(09):1666-1671.