首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 甲状腺癌论文 > 香菇多糖对甲状腺癌细胞生物学行为的影响

香菇多糖对甲状腺癌细胞生物学行为的影响

2023-09-22 76 上传者：管理员

摘要：研究香菇多糖(LNT)通过调控磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路对甲状腺癌细胞生物学行为的影响。方法将甲状腺癌TPC-1细胞分为空白组(常规培养)和低、中、高剂量实验组(20、40、60μmol•L-1 LNT);另用不同剂量PI3K抑制剂LY294002(0、5 mg•L-1)处理甲状腺癌TPC-1细胞，根据浓度分为对照组和LY294002组。以噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力，以Transwell实验检测细胞迁移及侵袭情况，以流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期，以蛋白质印迹法检测PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达。结果香菇多糖可呈时间及浓度依赖性抑制甲状腺癌TPC-1细胞增殖率(P<0.05)。空白组和低、中、高剂量实验组细胞迁移数分别为(127.67±8.09)、(98.00±5.76)、(77.67±6.25)、(38.33±5.13)个；细胞侵袭数分别为(144.50±12.50)、(109.67±6.02)、(83.00±8.07)、(50.00±4.65)个；细胞凋亡率分别为(5.82±1.37)%、(15.03±1.97)%、(26.86±2.57)%、(37.97±3.32)%; S期百分比分别为(32.09±2.49)%、(26.68±1.55)%、(21.07±2.19)%、(14.36±1.15)%,G2/M期百分比分别为(18.74±3.55)%、(16.47±3.62)%、(12.96±4.39)%、(12.41±1.66)%,G0/G1期百分比分别为(49.17±1.58)%、(56.86±2.37)%、(65.97±2.81)%、(73.23±1.63)%;低、中、高剂量实验组与空白组相比，差异均有统计学意义(均P<0.05)。与对照组相比，LY294002组能抑制TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭，促进TPC-1细胞凋亡(均P<0.05);与对照组相比，LY294002组G0/G1期细胞百分比升高，S期、G2/M期细胞百分比降低(均P<0.05)。结论 LNT可能通过PI3K/Akt信号通路抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭，诱导其凋亡，阻滞细胞周期。

关键词：
内分泌系统
甲状腺癌
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路
细胞增殖
香菇多糖
加入收藏

甲状腺癌(thyroid carcinoma, TC)是由多种因素引起且发病率约占内分泌系统恶性肿瘤的首位[1],该病高发人群为中老年人，且防治性差、复发率高，严重影响患者的生存质量。香菇多糖(lentinan, LNT)是一种属于免疫激活性多糖的香菇提取物，可作为提高肿瘤患者免疫力的临床治疗药物[2]。研究表明，LNT可以通过诱导肿瘤细胞凋亡提高化疗的有效率[3]。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-hydroxykinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信号通路在多种肿瘤的发生发展中被激活并呈异常高表达，与多种生物学过程如细胞增殖、侵袭、凋亡等密切相关[4]。本研究探讨LNT对甲状腺癌细胞生物学特性的影响及作用机制。

1、材料与方法

1材料

细胞甲状腺癌TPC-1细胞，购自北京北纳创联生物技术研究院(ATCC细胞库)。

药品与试剂LNT,纯度：≥98%,规格：每瓶5 mg,批号：69673072,上海迈瑞尔生化科技有限公司生产。RPMI-1640培养基、胎牛血清，均为美国Gibco公司生产；PI3K抑制剂LY294002、噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)试剂，均购自上海碧云天生物技术有限公司；二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、Annexin V/ PI凋亡试剂盒，均购自美国Sigma公司；兔抗人PI3K、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K,p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(phosphorylated Akt, p-Akt)抗体，均购自上海皓元生物科技有限公司。

仪器XSP-8CV图像生物显微镜，购自上海光学仪器厂；BriCyte E6迈瑞流式细胞仪，购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；HH34000000全波长酶标仪，购自上海玮驰仪器有限公司。

2实验方法

2.1细胞培养

将TPC-1细胞接种于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，放置在5% CO2、37℃培养箱中，等细胞融合度达90%以上时选取对数生长期的细胞。后续实验采用培养48 h后的TPC-1细胞。

2.2细胞分组及给药

取对数增殖期TPC-1细胞以2×105 cell·mL-1的密度接种于96孔板上，每孔100μL,随机分为4组，每组设6个复孔。其中空白组细胞正常培养，低、中、高剂量实验组加入20、40、60μmol·L-1 LNT。另取2组取对数增殖期TPC-1细胞分为LY294002组(加入5 mg·L-1 LY294002)和对照组(加入0 mg·L-1 LY294002)。

2.3以MTT法检测TPC-1细胞增殖情况[5]5]

取各组对数期TPC-1细胞接种于96孔板上，每组设6个复孔，在5% CO2、37℃、饱和湿度条件下培养24、48、72 h时，每孔加入MTT溶液10μL,孵育4 h后终止培养，加入DMSO 150μL,振荡10 min,用酶联免疫检测仪测量各个时点的光密度(optical density, OD)值。

2.4以Transwell法检测TPC-1细胞迁移和侵袭情况[6]6]

用无血清培养基将各组对数生长期TPC-1细胞重悬稀释。于24孔培养板中，将每组的细胞悬液200μL接种于Transwell上层小室，含胎牛血清的培养基600μL加入下层小室。孵育48 h后，取出小室经2次磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)清洗后，用4%多聚甲醛固定30 min滤膜，再用0.1%结晶紫染色20 min,在室温中放置20 min, PBS清洗后，用棉签轻擦去每个小室内膜表面未透过的细胞。

2.5以流式细胞仪检测TPC-1细胞凋亡情况[7]7]

取各组对数生长期TPC-1细胞悬液，经胰酶消化后，将细胞接种于孔板中，用PBS清洗2遍后，加入缓冲液制成重悬细胞，分别加入PI和FITC-AnnexinⅤ5μL,室温孵育15 min后，用流式细胞仪检测，并统计细胞凋亡率。

2.6以流式细胞仪检测TPC-1细胞周期[8]8]

将各组对数生长期TPC-1细胞悬液接种于6孔板上，在细胞贴壁更换培养基后培养48 h,然后胰酶消化，收集细胞于流式管中，离心后弃上清液，用PBS清洗2次，加入70%预冷的乙醇，4℃下固定，过夜后再离心，PBS清洗2次后，用PI染液避光染色30 min,用流式细胞仪进行检测。

2.7以蛋白质印迹法检测蛋白表达情况[9]9]

将各组的甲状腺癌TPC-1细胞加入细胞裂解液，从中提取总蛋白。将细胞总蛋白电泳分离，然后移至聚偏二氟乙烯膜，用封闭液稀释一抗(1∶1 000)孵育1 h后，加入TBST洗涤3次，在4℃摇床上反应过夜，添加山羊抗兔二抗(1∶2 000)后在温室下摇床孵育1 h根据一抗选择二抗，添加二抗(1∶5 000)后在温室下摇床孵育1 h,然后加入TBST洗涤3次。将膜放在发光仪上，加上混合后的发光液进行曝光，计算蛋白含量。以GAPDH为内参进行分析。

3统计学处理

用SPSS 21.0软件处理数据。计量资料用x¯±s表示，多组间比较用单因素方差分析，2组间比较用LSD-t检验。

2、结果

1 LNT对TPC-1细胞增殖率的影响

空白组细胞正常培养，低、中、高剂量实验组加入20、40、60μmol·L-1LNT。与空白组相比，TPC-1细胞经不同浓度LNT处理后，细胞增殖率明显降低。处理后24 h、48 h和72 h时，低、中、高剂量实验组对TPC-1细胞增殖活力均降低(均P<0.05),且呈时间及剂量依赖性，见表1。

2 LNT对TPC-1细胞迁移及侵袭能力的影响

与空白组比较，低、中、高剂量实验组细胞迁移及侵袭数均降低(均P<0.05);且随着LNT浓度的增加，细胞迁移及侵袭数依次减少(均P<0.05),见表2。

3 LNT对TPC-1细胞凋亡的影响

低、中、高剂量组细胞凋亡率分别为(15.03±1.97)%、(26.86±2.57)%、(37.97±3.32)%,随着LNT浓度的增加而依次增加(P<0.05),且与空白组细胞凋亡率(5.82±1.37)%相比均明显升高(均P<0.05)。

4 LNT对TPC-1细胞周期的影响

与空白组比较，低、中、高剂量实验组G0/G1期细胞百分比均升高，S期、G2/M期细胞百分比均降低(均P<0.05)。随着LNT浓度的升高，G1期细胞百分比依次升高，S期、G2/M期细胞百分比依次降低，见表3。

表1不同浓度的香菇多糖(LNT)对TPC-1细胞增殖率的影响(x¯±s)

5 LNT对TPC-1细胞中PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响

与空白组比较，低、中、高剂量实验组TPC-1细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平均明显降低(均P<0.05),并且随着LNT浓度的升高，TPC-1细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平依次减少(均P<0.05),见表4和图1。

6 PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对TPC-1细胞生物学行为的影响

与对照组相比，PI3K/Akt通路抑制剂LY294002抑制TPC-1细胞增殖、迁移和侵袭，促进TPC-1细胞凋亡(P<0.05);与对照组相比，LY294002组G0/G1期细胞百分比升高(P<0.05),S期、G2/M期细胞百分比降低(P<0.05),见表5。

表2 LNT对TPC-1细胞迁移及侵袭能力的影响(x¯±s)

表3 LNT对TPC-1细胞周期的影响(x¯±s)

表4 LNT对TPC-1细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表达水平的影响(x¯±s)

表5 PI3K/Akt通路抑制剂LY294002对TPC-1细胞生物学行为的影响(x¯±s)

图1各组细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平

3、结论

临床上甲状腺癌常采用手术结合化放疗治疗，但手术治疗可能会引发消化不良等并发症，长期化疗容易给患者带来神经毒性、骨髓抑制等药物不良反应[10,11]。LNT具有毒性小、安全性高、药物不良反应发生率低等优势，其可能通过抑制Akt通路进而促进线粒体凋亡途径和抑制微管蛋白聚合来诱导肿瘤细胞凋亡[12]。

本研究结果显示，低、中、高剂量实验组TPC-1细胞中增殖率与空白组相比明显降低，且随着LNT浓度的升高，细胞增殖率逐渐下降，提示LNT对癌细胞有着抑制增殖作用，并且存在一定的浓度和时间依赖性。癌细胞的侵袭力与癌症的发展和转移有着密切的关系，而甲状腺癌细胞转移能力较强，导致患者预后较差、生存期缩短。本研究结果显示，低、中、高剂量实验组细胞迁移及侵袭数与空白组相比均依次降低，表明LNT可以抑制甲状腺癌细胞的迁移及侵袭能力，并且存在一定的量效关系。本研究通过检测细胞的凋亡情况，结果显示，随着LNT浓度的增加，细胞凋亡率依次升高，说明甲状腺癌细胞的凋亡可被LNT诱导。本研究结果显示，LNT以剂量依赖性地升高(G0/G1)期细胞百分率，降低S期、G2/M期细胞百分率，说明LNT可以降低细胞G1期向S期转换率，诱导周期阻滞。

PI3K/Akt是与细胞增殖、凋亡有关的信号传导通路，可以参与细胞增殖和蛋白质合成，异常活化时可导致细胞恶性转化和异常增殖[13]。本研究结果显示，低、中、高剂量实验组的细胞PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白水平与空白组相比明显降低，说明LNT可能参与调控PI3K/Akt信号通路的激活。另外，本研究通过PI3K/Akt通路抑制剂LY294002处理TPC-1细胞后，发现细胞凋亡率增加，增殖、迁移及侵袭能力降低，与本研究中LNT处理TPC-1细胞效果类似，说明PI3K/ Akt信号通路受到阻断后可影响TPC-1细胞生物学行为。

参考文献:

[1]殷益飞,李红,杨春生,等.HYAL2基因DNA甲基化水平可用于甲状腺良恶性肿瘤的鉴别诊断[J]南方医科大学学报, 2022 42(1):123-129.

[2]苏畅,李小江,贾英杰,等.香菇多糖的抗肿瘤作用机制研究进展[J]中草药,2019,50(6):1499-1504.

[3]南君,许春进香菇多糖配合化疗对肝癌患者肝功能､T细胞亚群及IL-12､sIL-2R的影响[J.中西医结合肝病杂志,2018,28(3):153-155.

[4]刘铁钢,闻毒艳,申铉三银杳叶提取物对甲状腺癌细胞PI3K/Akt信号通路的影响及意义[J]中国老年学杂志,2020,40(2):410-412.

[5]李宇,徐瑾,贺会清,等二甲双胍对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞凋亡的影响及其机制研究[J.临床内科杂志,2019,36(12)-838-841.

[6]肖传柳,林鸿昌,罗杨,等小白菊内酯通过调控微小RNA-637表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖､迁移和侵袭的研究[J]中国临床药理学杂志,2022,38(16):1915-1919.

[7]王霞,许瑶,许尤琪猫人参通过自噬对恶性转化的人胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡的影响[J]中国临床药理学杂志,2022,38(15)-:1766- 1769.

[8]胡娜,盛磊,饶辉,等淫羊蓉素对肝癌HepG2细胞的抗增殖作用及其机制研究[J]中国临床药理学杂志,2022,38(16):1887-1891.

[9]梁林林,孙静莉敲减跨膜蛋白16A激活信号传导及转录激活蛋白3表达抑制卵巢癌细胞增殖和迁移的研究[J]中国临床药理学杂志, 2022,38(15):1774-1777.

[12]张琪琳,杜兆松,王凯平,等香菇多糖抑制Akt通路和微管蛋白聚合诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制[J].中国医院药学杂志,2016,36(23):2046-2051.

[13]刘卫国,张情,侯俊杰,等白藜芦醇对人甲状腺乳头状癌细胞lHH4细胞恶性生物学特征及PI3K/Akt信号通路影响[J]广西医科大学学报,2021,38(9):1647-1653.