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美登木素对人乳头状甲状腺癌B-CPAP细胞增殖和凋亡的研究

2023-11-29 118 上传者：管理员

摘要：目的探讨美登木素对人乳头状甲状腺癌B-CPAP细胞增殖、凋亡的影响及作用机制。方法用不同浓度（0.19、0.76、3.05、12.21、48.83、195.31、781.25、3 125 nmol/L）的美登木素溶液处理B-CPAP细胞，SRB法检测B-CPAP细胞增殖情况。将B-CPAP细胞分为对照组及美登木素（0.1、1、10 nmol/L）组，光学显微镜观察B-CPAP细胞形态变化；流式细胞术检测B-CPAP细胞凋亡情况；Western blotting法测定B-CPAP细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3前体（Procaspase-3）的蛋白表达量。结果与对照组比较，美登木素能有效抑制B-CPAP细胞增殖，且呈浓度及时间相关性；随美登木素浓度增加B-CPAP细胞凋亡率逐渐升高，Bcl-2和Procaspase-3蛋白表达水平下降（P<0.05），呈明确的浓度相关性。结论美登木素具有抑制B-CPAP细胞增殖及诱导凋亡的作用，其机制可能与调控Bcl-2和Procaspase-3蛋白有关。

关键词：
B淋巴细胞瘤-2
人乳头状甲状腺癌
细胞凋亡
细胞增殖
美登木素
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甲状腺癌属于内分泌恶性肿瘤，在我国已成为发病率增长最快的恶性肿瘤之一[1]。甲状腺乳头状癌是甲状腺癌最常见的类型，可通过手术、放射性碘、促甲状腺激素抑制进行治疗[2,3,4,5]。虽然能获得较长时间的无疾病生存期，但是仍有部分患者在治疗过程中进展为碘难治性甲状腺癌，生存期大大缩短，严重危害患者生命。因此，临床上仍需寻找安全有效的治疗药物，来提高甲状腺癌患者生存率，降低死亡率，改善患者的生活质量。

微管靶向剂（MTAs）是癌症化疗中最成功的抗癌药物。通过干扰微管蛋白聚合和解聚动力学，影响细胞内运输和细胞信号通路，抑制细胞有丝分裂和细胞增殖，诱导细胞凋亡和死亡[6,7]。美登木素作为一种高效的MTAs，可在较低浓度下杀死肿瘤细胞。1972年，由美国植物学家Kupchan及其同事在埃塞俄比亚和肯尼亚产的卵叶美登木中分离得到，并发现其对小鼠白血病P388细胞、黑色素瘤B16细胞、Lewis肺癌等有效[8]。随后，我国科研人员在一种国产云南美登木中也成功提取到美登木素[9]。近年来的研究表明，美登木素对体外培养的人肺癌A549、鼻咽癌细胞也具有明确地抑制作用[10,11]，但其对甲状腺癌的作用研究较少。为此，本研究以人甲状腺乳头状癌B-CPAP细胞为研究对象，探讨了美登木素对甲状腺癌的作用及机制，为其临床上治疗甲状腺癌提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 细胞来源

人源B-CPAP细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2 药品与试剂

美登木素（质量分数≥99.80%，美国MCE公司，批号95688);SRB（美国Sigma公司，批号S1402）；三氯乙酸（TCA，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20190304);Annexin-FITC凋亡试剂盒（美国Immunoway公司，货号KC0001);Procaspase-3（美国Proteintch公司，货号19677-I-AP);Bcl-2抗体（美国Abcam公司，货号ab32124）；山羊抗兔Ig G/辣根酶标记二抗（美国Immunoway公司，货号RS0002）。

1.3 仪器

FACSCanto II流式细胞仪（美国BD公司）；Infinite M200酶联免疫检测仪（瑞士Tecan公司）；HERA Cell 150i CO2培养箱（美国Thermo公司）；IM倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；垂直凝胶电泳仪及配套设备（美国BIO-RAD公司）；LAS500凝胶成像一体机（美国GE公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养

B-CPAP细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液置于37℃、5%CO2培养箱中培养，3～4 d胰酶消化传代1次。

1.4.2 美登木素溶液的配制

称取美登木素2 mg，加入二甲基亚砜2.7 m L，于超声震荡仪中超声2 min使充分溶解，配制成1 mmol/L的储备溶液。用含10%胎牛血清的RPMI1640液稀释成不同浓度的待测溶液。

1.4.3 SRB法测定美登木素对B-CPAP细胞增殖抑制率[12]

取对数生长期的B-CPAP细胞，胰酶消化后调整密度为1×105个/m L，接种于96孔板中，每孔100μL。37℃含5%CO2的培养箱中培养24 h，加入不同质量浓度的美登木素溶液，使其最终浓度分别为0.19、0.76、3.05、12.21、48.83、195.31、781.25、3 125 nmol/L。同时设对照组，每孔100μL。继续培养24～72 h后，每孔加入50μL预冷的50%TCA溶液固定，4℃放置1 h后，用蒸馏水反复洗涤，空气中自然干燥。干燥后每孔加入由冰醋酸配制的SRB溶液100μL，室温中染色10 min。弃去上清液，用1%醋酸反复洗涤，空气中自干。最后每孔加入Tris溶液150μL，于515 nm处测定各孔吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。

1.4.4 光学显微镜观察美登木素对B-CPAP细胞形态的影响

取对数生长期的B-CPAP细胞，调整密度为1×105个/m L，接种于6孔板中，每孔2.5 m L。贴壁24 h后，分为对照组，低、中、高浓度美登木素组。对照组用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，而低、中、高浓度美登木素组剂量分别采用48 h半数抑制浓度（IC50）的0.05、0.5、5倍，即终浓度为0.1、1、10 nmol/L的美登木素溶液培养。培养箱中培养48 h后，倒置显微镜下观察各组细胞的形态学变化。

1.4.5 流式细胞仪检测美登木素对B-CPAP细胞凋亡的促进作用

参照1.4.4项下，设置美登木素终浓度为0.1、1、10 nmol/L组和对照组。于药物作用后48 h，用不含EDTA的胰酶消化后，2 000 r/min，离心收集细胞。用冷PBS洗涤细胞，2 000 r/min离心。弃去上清，取细胞沉淀重悬于1×binding buffer缓冲液中，加入Annexin V-FITC和PI溶液各5μL并混匀。在避光情况下室温孵育15 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.4.6 Western blotting法测定美登木素对B-CPAP细胞中Bcl-2、Procaspase-3蛋白水平表达变化

参照1.4.4项下，设置美登木素0.1、1、10 nmol/组和对照组。于药物作用后48 h，弃去培养液，加4℃预冷的PBS，平放轻轻摇动1 min洗涤细胞。加含PMSF的裂解液，于冰上裂解。裂解完后，用移液器将细胞碎片和裂解液移至1.5 m L离心管中。于4℃下12 000 r/min离心。将离心后的上清转移至1.5 m L的离心管中。BCA法检测蛋白浓度后，每孔蛋白上样量20μg,SDS-PAGE电泳后湿转法转膜。以脱脂牛奶封闭PVDF膜，TBST缓冲液清洗后，加一抗冰箱4℃孵育过夜。次日用TBST缓冲液洗膜，加二抗室温孵育后洗膜。最后，将PVDF膜置于凝胶成像一体机中，滴加发光液后，测定目的蛋白条带。

1.5 数据处理

采用SPSS 17.0软件进行数据统计和分析，数据用表示。采用单因素方差分析行组间比较。

2、结果

2.1 美登木素对B-CPAP细胞增殖抑制作用

由图1可见，不同浓度的美登木素对B-CPAP细胞的增殖均具有不同程度的抑制作用，且随着药物浓度的增加，抑制程度递增，具有剂量相关性。随着美登木素作用时间延长，抑制程度也随之增加。24、48、72 h的IC50分别为46.191、1.827、1.072 nmol/L，呈明显的时间相关性。

2.2 美登木素对B-CPAP细胞形态的影响

倒置显微镜下观察发现，对照组B-CPAP细胞胞质饱满，呈圆形或长梭形，相邻细胞生长融合成片。经美登木素处理后48 h，随着美登木素浓度增加，细胞数逐渐减少、间隙增大、细胞碎片增多、折光性变差，几无片状细胞生长区，见图2。

2.3 美登木素对B-CPAP细胞凋亡的影响

通过流式细胞术检测发现，与对照组相比，美登木素处理B-CPAP细胞48 h后，随药物浓度递增，细胞凋亡比例也随之增加（P<0.05），见图3、表1。

2.4 美登木素对B-CPAP细胞中Bcl-2、Procaspase-3蛋白表达的影响

与对照组相比，经0.1、1、10 nmol/L美登木素处理后的B-CPAP细胞，Bcl-2和Procaspase-3蛋白的表达水平随药物浓度的升高逐渐降低（P<0.05），见图4。

3、讨论

从天然活性成分中寻找低毒、高效的药物，一直是抗肿瘤研究的热点。近代药理学研究表明，盐酸石蒜碱、姜黄素、白藜芦醇、小檗碱、毛蕊异黄酮、小白菊内酯等单体成分可通过调控相关通路和蛋白在体内外抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖[13,14,15,16,17,18]。而自发现美登木素以来，科研人员对美登木属植物的化学成分及其生物活性进行了大量研究。近年来其抗肿瘤方面的研究主要集中在肺癌和鼻咽癌，但对甲状腺癌的研究鲜有报道。作为MTAs中的微管聚合抑制剂即微管失稳剂，美登木素可通过与微管蛋白的不可逆结合，使得微管自身的结构发生改变，抑制微管的聚合生长，让微管自身的动力学性质发生转变，从而妨碍细胞有丝分裂时纺锤体的形成，阻滞细胞有丝分裂，达到抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡的目的[19]。本研究采用SRB法观察了不同浓度的美登木素对体外培养的人乳头状甲状腺癌B-CPAP细胞的生长影响。结果表明，美登木素能明显抑制该细胞增殖，并呈剂量和时间相关性。此外，美登木素对B-CPAP细胞有显著的凋亡诱导作用。且随作用浓度的增加，细胞凋亡率显著增加（P<0.05）。

细胞凋亡指生理或病理状态下，机体为维持内环境稳定而出现的细胞程序性死亡。细胞凋亡水平的下调与肿瘤发生发展密切相关。近年来，细胞凋亡相关分子途径已成为肿瘤诊治策略制定及相关药物研发的关注目标[20]。其中Bcl-2和Caspase-3是抗肿瘤的有效靶点[21,22]。Caspase-3是细胞凋亡过程中最关键的执行分子之一，正常情况下，Caspase-3以Procaspase-3的形式存在，当Procaspase-3接收到凋亡信号后，被催化裂解成为Caspase-3，进而诱导细胞凋亡。由于肿瘤细胞中的Caspase-3被抑制，无法进行正常细胞凋亡，导致酶原Procaspase-3呈现高表达状态。因此，直接激活Procaspase-3成为Caspase-3，可诱导肿瘤细胞凋亡，达到抗肿瘤的目的[23,24,25]。为了探讨美登木素诱导B-CPAP细胞凋亡的可能机制，本研究采用Western blotting法检测了细胞中Bcl-2和Procaspase-3蛋白表达的情况。结果发现，美登木素培养48 h后，B-CPAP细胞中Bcl-2和Procaspase-3蛋白表达较细胞对照组明显降低。

综上所述，本研究通过体外实验发现美登木素对人乳头状甲状腺癌B-CPAP细胞具有抑制增殖、诱导调亡的活性，其作用机制可能与调控Bcl-2、Procaspase-3蛋白表达有关，为其临床应用的可行性提供了充分的依据。

参考文献:

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