甲状腺癌是最常见的恶性内分泌癌[1],其中未分化甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer, ATC)是一种具有高侵袭性的甲状腺癌，在所有甲状腺癌中的发病率为1.5%,但却是所有甲状腺癌相关死亡的主要原因，由于其高转移率，ATC患者的生存率很低，因此探索ATC所涉及的分子机制并确定改进ATC治疗策略至关重要[2,3]。

高良姜素(Galangin)是中药高良姜中提取到的类黄酮类化合物，多个报道发现Galangin在癌细胞进展中发挥抑制作用[4],比如CHIEN等[5]发现Galangin抑制肝癌细胞HepG2活力，抑制HepG2细胞侵袭和迁移，认为Galangin可能作为抗转移药物在临床治疗中具有广泛的应用。卢丹等[6]发现Galangin促进胰腺癌细胞PCNA-1凋亡，抑制移植瘤生长，上述研究表明Galangin在多种癌症中发挥抑癌作用。

Hippo信号通路是可调节细胞生长以及器官大小的重要通路，异常调控将导致组织过度生长[7],其上游调控因子缺失会导致其下游转录因子Yes相关蛋白(Yes-associated protein, YAP)/具有PDZ结合基序的转录共激活蛋白(transcriptional coactivator with PDZ binding motif, TAZ)异常激活，比如哺乳动物STE20样蛋白激酶1和2(mammalian STE20-like kinase 1/2,MST1/2)缺失等，从而引起细胞过度增殖[8]。Hippo信号通路在肿瘤领域引起大量关注，研究证实非编码RNA MAPK8IP1P2通过激活Hippo信号通路抑制甲状腺癌淋巴转移[9],另有研究表明黄酮类化合物野黄芩苷激活Hippo信号通路活性，抑制结肠癌细胞增殖、迁移，并诱导其凋亡[10],表明在癌症发展中Hippo信号通路发挥重要作用，激活Hippo信号通路可能抑制癌细胞恶性进展。因此本文以8505C细胞为体外模型，研究Galangin对8505C细胞恶性生物学行为的影响，初步探索其机制，为ATC治疗药物研发提供实验依据。

1、材料与方法

1.1 实验材料

人甲状腺癌8505C细胞购自丰晖生物。

1.2 主要试剂

Galangin(MCE公司);CCK-8试剂盒(默克公司);EDU细胞增殖检测试剂盒(锐博生物);Hippo信号通路特异性抑制剂XMU-MP-1(上海爱必信生物公司);兔源抗体MST1、YAP、TAZ、MMP2、Ki67、GAPDH(CST公司)。

1.3 细胞培养

将8505C细胞用含10%血清的DMEM进行培养，培养环境为含5%CO2,37 ℃的培养箱。

1.4 CCK-8实验检测不同浓度Galangin对8505C细胞存活率的影响

将消化后8505C细胞接种于96孔板中，按照参考文献[11]分别加入不同浓度的Galangin(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)进行培养，培养24 h后弃去培养基，加入新鲜培养基并在每孔加入10 μL CCK-8试剂，继续放回温箱孵育2 h, 2 h后酶标仪检测450 nm处OD值，计算细胞存活率。

1.5 实验分组

8505C细胞分为对照组、Galangin组、Galangin+DMSO组、Galangin+XMU-MP-1组。对照组不作处理，Galangin组培养基中加入40 μmol/L Galangin; Galangin+XMU-MP-1组培养基中加入40 μmol/L Galangin和10 μg/mL XMU-MP-1[12];Galangin+DMSO组培养基中加入40 μmol/L Galangin和等量DMSO。

1.6 EDU法检测各组8505C细胞增殖

将消化后8505C细胞接种于96孔板，贴壁后加入各组培养基继续培养24 h, 24 h后根据EDU细胞增殖检测试剂盒依次进行操作，最后进行荧光成像检测。

1.7 Transwell检测各组8505C细胞侵袭

Transwell上室提前包被Matrigel胶，干燥后加入各组细胞悬液，不含血清，Transwell下室加入完全培养基，温箱孵育24 h后，擦去没有侵袭细胞，固定用结晶紫染色，镜下观察并计数，计算侵袭细胞数量。

1.8 划痕实验检测各组8505C细胞迁移

将消化后8505C细胞接种于24孔板，培养过夜后用枪头尖在细胞板底部划十字，按照分组加入各组培养基继续培养细胞，0 h和48 h时荧光显微镜下观察各组细胞划痕愈合情况，Image J软件分析划痕面积，计算划痕愈合率。

1.9 流式细胞术检测各组8505C细胞凋亡率

将各组8505C细胞培养24 h后，胰酶消化细胞，离心后PBS进行漂洗，然后根据AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明操作， 最后流式细胞仪检测各组8505C细胞凋亡率。

1.10 RT-qPCR检测各组8505C细胞MST1、YAP、TAZ mRNA水平

将各组8505C细胞培养24 h后，弃去上清，PBS清洗后加入Trizol试剂裂解细胞，提取RNA,RNA经反转录试剂盒得到cDNA,将获得cDNA用提前设计引物进行特异性扩增，检测各组8505C细胞中MST1、YAP、TAZ mRNA水平。引物序列如下：MST1上游5'-GGTGCAATGGCGAGGAATAC-3';下游5'-CGGCAATAGTTGTCGTCCAG-3'。YAP上游5'-CCCTCGTTTTGCCATGAACC-3';下游5'-GTTGCTGCTGGTTGGAGTTG-3'。TAZ上游5'-CAGCAATGTGGATGAGATGG-3';下游5'-TCATTGAAGAGGGGGATCAG-3'。GAPDH上游5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3';下游5'-AATGGTCGTTGAGGGCAATG-3'。数据用2-ΔΔCt法进行分析，计算MST1、YAP、TAZ 的相对表达量。

1.11 Western blot检测各组8505C细胞MST1、YAP、TAZ、MMP2、Ki67、cleaved-Caspase3、Caspase3蛋白表达水平

将各组8505C细胞培养24 h后，弃去上清，PBS清洗后加入RIPA试剂裂解细胞，提取蛋白，蛋白BCA法定量后进行SDS-PAGE凝胶电泳，将分离开条带转印至PVDF膜，转印结束将膜用脱脂乳进行封闭，封闭结束弃去脱脂乳，加入提前稀释好抗体(MST1、YAP、TAZ、MMP2、Ki67、cleaved-Caspase3、Caspase3)与膜4 ℃过夜孵育，次日收集抗体，将膜用PBST洗涤3遍，每次10分钟，加入提前稀释好二抗室温孵育2 h, 2 h后收集二抗，将膜用PBST洗涤3遍，每次10分钟，将膜进行ECL显色，凝胶系统成像，Image J软件分析蛋白灰度值。

1.12 数据分析

本实验数据用Graphpad Prism7.0软件进行分析，数据以平均值±标准差表示。多组间分析用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P<0.05时差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 不同剂量Galangin对8505C细胞存活率的影响

CCK-8结果显示，Galangin呈剂量依赖性降低8505C细胞存活率(P<0.05),当Galangin剂量为40 μmol/L时结果最接近IC50,因此后续选择40 μmol/L浓度进行实验，结果见图1和表1。

图1 不同剂量Galangin对8505C细胞存活率影响的IC50曲线   

表1 不同剂量Galangin对8505C细胞存活率的影响

2.2 各组8505C细胞增殖能力比较

与对照组相比，Galangin组8505C细胞EDU阳性细胞率显著性降低(P<0.05);与Galangin+DMSO组相比，Galangin+XMU-MP-1组8505C细胞EDU阳性细胞率显著性升高(P<0.05),见图2。

2.3 各组8505C细胞侵袭能力比较

与对照组相比，Galangin组8505C细胞侵袭数量显著性降低(P<0.05);与Galangin+DMSO组相比，Galangin+XMU-MP-1组8505C细 胞侵袭数量显著性升高(P< 0.05),见图3。

图2 EDU染色检测各组8505C细胞增殖情况   

图3 Transwell检测各组8505C细胞侵袭情况(结晶紫染色)  

2.4 各组8505C细胞迁移情况比较

与对照组相比，Galangin组8505C细胞划痕愈合率显著性降低(P<0.05);与Galangin+DMSO组相比，Galangin+XMU-MP-1组8505C细胞 划痕愈合率显著性升 高(P<0.05),见图4。

图4 划痕实验检测各组8505C细胞迁移情况   

2.5 各组8505C细胞凋亡率比较

与对照组相比，Galangin组8505C细胞凋亡率显著性升高(P<0.05);与Galangin+DMSO组相比，Galangin+XMU-MP-1组8505C细胞凋亡率显著 性降低(P<0.05),见图5。

图5 流式细胞术检测各组8505C细胞凋亡率   

2.6 各组8505C细胞MST1、YAP、TAZ mRNA表达水平比较

与对照组相比，Galangin组8505C细胞MST1 mRNA表达水平显著性升高，YAP、TAZ mRNA表达水平显著性降低(P<0.05);与Galangin+DMSO组相比，Galangin+XMU-MP-1组8505C细胞MST1 mRNA表达水平显著性降低，YAP、TAZ mRNA表达水平显著性升高(P<0.05),见图6。

2.7 各组8505C细胞MST1、YAP、TAZ、MMP2、Ki67、cleaved-Caspase3、Caspase3蛋白表达水平比较

与对照组相比，Galangin组8505C细胞MST1、cleaved-Caspase3/Caspase3蛋白水平显著性升高，YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白水平显著性降低(P<0.05);与Galangin+DMSO组相比，Galangin+XMU-MP-1组8505C细胞MST1、cleaved-Caspase3/Caspase3蛋白水平显著性降低，YAP、TAZ、MMP2、Ki67蛋白水平显著性升高(P<0.05),见图7。

图6 RT-qPCR检测各组8505C细胞MST1、YAP、TAZ mRNA水平   

图7 Western blot检测各组8505C细胞MST1、YAP、TAZ、MMP2、Ki67、cleaved-Caspase3、Caspase3蛋白表达  

3、讨论

甲状腺癌可分为三种主要组织学类型：分化、未分化和髓质甲状腺癌[13],其中未分化癌ATC是一种罕见但具有很强侵袭性的滤泡细胞癌，虽然常规治疗可以提高患者的生存率，但致死率仍然很高[14],因此迫切需要更有效的ATC治疗手段。

据报道，类黄酮在各种肿瘤细胞中表现出抑制作用[15,16],Galangin是来自高良姜的一种类黄酮化合物，SONG等[17]研究发现Galangin抑制乳腺癌细胞活力，诱导乳腺癌细胞凋亡，表明Galangin对乳腺癌具有潜在的应用前景。LONG等[18]研究发现Galangin通过促进p53信号通路诱导膀胱癌细胞凋亡，以上研究均表明Galangin对癌细胞具有抑制作用，而关于Galangin对ATC癌细胞发挥的作用尚不清楚，因此本文选择8505C细胞，研究Galangin对8505C细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响。本文结果显示，Galangin干预8505C细胞后，细胞增殖能力下降，细胞侵袭数量减少，细胞迁移能力降低，表明Galangin抑制8505C细胞恶性生物学行为。接着检测8505C细胞凋亡情况，发现Galangin组8505C细胞凋亡率显著性升高，上述研究证实Galangin抑制8505C细胞增殖、迁移、侵袭，并诱导8505C细胞凋亡。

在肿瘤领域，Hippo信号通路引起广泛关注[19],研究发现Hippo信号通路异常阻滞影响肿瘤细胞增殖、侵袭和耐药性等[20]。Hippo信号通路包括上游调控因子、下游转录共激活因子(YAP/TAZ等)、下游调节因子等[21]。YAP/TAZ促进细胞增殖，在恶性肿瘤中被过度激活，Hippo通路主要功能是负调节YAP/TAZ活性，YAP/TAZ异常激活与上游调控因子缺失相关，比如MST1/2缺失，导致YAP/TAZ过度激活[8],因此激活Hippo信号通路将有助于抑制细胞过度增殖。为了揭开Hippo信号通路在甲状腺癌中水平以及Galangin发挥作用和此通路关系，本文检测8505C细胞中Hippo通路关键蛋白MST1、YAP的表达水平，通过RT-qPCR和免疫印迹实验分别检测MST1、YAP、TAZ的mRNA和蛋白水平，结果显示在8505C细胞中，MST1低表达，YAP、TAZ高表达，Galangin干预后8505C细胞MST1 mRNA和蛋白水平显著性上升，YAP、TAZ mRNA和蛋白水平显著性下调，发现Hippo信号通路被激活，提示Galangin可能通过激活Hippo信号通路发挥其抑癌作用。为进一步验证此结果，将Galangin和Hippo信号通路特异性抑制剂XMU-MP-1联合处理细胞，结果发现抑制Hippo信号通路后8505C细胞增殖、迁移、侵袭均增加，且细胞凋亡率下降，表明抑制Hippo信号通路逆转Galangin对8505C细胞恶性行为的抑制作用，进一步验证Galangin通过激活Hippo信号通路抑制甲状腺癌细胞8505C的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，本文发现Galangin可显著抑制甲状腺癌细胞8505C增殖、侵袭、迁移，且诱导8505C细胞凋亡，其作用机制可能是通过激活Hippo信号通路发挥作用，但对于不同来源的甲状腺癌细胞系是否发挥相同作用仍需进一步探讨。

参考文献:

[6]卢丹,彭小兰,熊珊,等.高良姜素促进胰腺癌PCNA-1细胞凋亡和自噬并抑制移植瘤生长[J].广州中医药大学学报,2021,38(9):1963-1971.

[10]杨寒,任珊,刘茂伦,等.基于Hippo信号通路的野黄芩苷抗结直肠癌HCT116细胞的研究[J].天然产物研究与开发,2023,35(1):22-32.

[11]陈淑梅.高良姜素诱导人乳头瘤病毒阳性的宫颈癌细胞凋亡实验研究[J].中草药,2017,48(5):941-945.

[12]陈明明,李克寒,刘相乐,等.依托咪酯通过调节Hippo信号通路抑制鼻咽癌细胞CNE-1和HNE-1的侵袭迁移[J].广东药科大学学报,2020,36(6):840-846.

基金资助:贵州省六盘水市科技计划项目(编号:52020-2020-0-2-10);

文章来源:毛洪绪,王光远,孟祥宁等.高良姜素通过调节Hippo信号通路抑制甲状腺癌细胞的增殖､迁移和侵袭[J].现代肿瘤医学,2024,32(04):595-600.