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LncRNA HULC在乳头状甲状腺癌组织中的表达及意义

2024-06-04 107 上传者：管理员

摘要：目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)肝癌高表达转录本(HULC)在乳头状甲状腺癌组织中的表达及意义。方法选取90例乳头状甲状腺癌(PTC)患者作为研究对象，手术过程中采集PTC组织和距肿瘤边缘2 cm以上的癌旁组织，通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测HULC相对表达量。将不同序列转染TPC-1细胞，依据转染序列分为Si-HULC组、Si-Con组、空白组，分别对三组的HULC表达量、细胞增殖活性和侵袭能力进行检测。结果 PTC组织的HULC相对表达量明显高于癌旁组织(P<0.05)。肿瘤直径≤2 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的PTC癌组织HULC相对表达量明显高于肿瘤直径>2 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移者(P<0.05)。与Si-HULC组比较，Si-Con组和空白组24、48、72、96 h的A值明显更高(P<0.05)。与Si-HULC组比较，Si-Con组和空白组HULC相对表达量明显更高，侵袭细胞数量明显更多(P<0.05)。结论 HULC在PTC组织中相对表达量较高，且与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移存在密切关联，只有尽早调节HULC,才能有效降低TOC-1细胞的增殖活性和侵袭能力。

关键词：
LncRNA
乳头状甲状腺癌
甲状腺癌
肝癌高表达转录本
长链非编码RNA
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甲状腺癌是临床常见的内分泌恶性肿瘤，根据其组织学特征可分为分化型甲状腺癌(乳头状癌、滤泡型癌)、未分化型甲状腺癌、甲状腺髓样癌几种，其中以乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)最为常见[1]。PTC在甲状腺癌发病率中占80%～90%,相较于其他类型而言恶性程度较低，但其起病较为隐匿，且早期转移和复发的几率较大，部分患者治疗后极有可能出现预后不良的情况，严重者甚至还会直接死亡[2]。因此，只有尽早明确PTC的转移、复发风险，并及时采取合适的措施治疗，才能有效改善患者的预后[3]。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是长度超过200个核苷酸的RNA,可通过参与染色体结构调节、基因转录等遗传过程的方式对恶性肿瘤的发生、发展进行调控[4]。肝癌高表达转录本(highly up-regulated in liver cancer, HULC)是一种新发现的lncRNA,在多种恶性肿瘤组织中均呈现出高表达，具有促进肿瘤细胞侵袭、转移的作用[5]。基于此，本次研究将对lncRNA HULC在乳头状甲状腺癌组织中的表达及意义进行分析，报告如下。

1、资料与方法

1.1 一般资料

纳入标准：符合《甲状腺微小乳头状癌诊断与治疗中国专家共识(2016版)》[6]相关诊断标准；病理检查确诊为PTC;TNM分期Ⅰ～Ⅳ期；自愿参与且已签署知情同意书。排除标准：合并其他恶性肿瘤；合并器质性功能障碍；存在其他类型的甲状腺疾病；近期服用影响甲状腺功能药物。根据纳入、排除标准于2020年4月至2022年4月选取90例PTC患者进行研究，男性50例，女性40例；年龄22～86岁，平均(58.65±5.65)岁；TNM分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期27例，Ⅲ期18例，Ⅳ期10例。本次研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2 方法

PTC组织和癌旁组织HULC相对表达量检测：于手术过程中采集PTC组织和癌旁组织标本(距肿瘤边缘2 cm以上),剪碎研磨后将细胞裂解液加入标本中，应用试剂盒提取总RNA,通过UV1902PC紫外分光光度计检测纯度，纯度标准：A260 nm/A280 nm比值>1.80。采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为互补DNA(complementary DNA,cDNA),将其作为模板，采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)检测HULC相对表达量。反应条件：94 ℃,2 min; 94°,30 s; 58 ℃,30 s; 74 ℃,30 s, 循环38个。引物序列：HULC上游引物：5'-ACCTCCAGAACTGTGATCCAAAATG-3',下游引物：5'-GCCAGGAAACTTCTTGCTTGA-3 ';GAPDH上游引物：5'-CCCTTCATTGACCTCAACTA-3',下游引物：5'-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。PTC组织和癌旁组织HULC相对表达量采用2-△△Ct法计算。细胞培养及处理：选择胎牛血清(1∶9)和RPMI1640培养基共同制作完全培养基，于37 ℃、5% CO2环境下培养TPC-1细胞(24 h),胰蛋白酶消化，传代培养，重悬计数后接种于6孔板中(2.5×105个/孔),细胞融合度≥80%后采用Lipofectamine 2000试剂转染。根据转染序列进行分组，包括转染HULC的小分子干扰序列组(Si-HULC组)、转染阴性对照组序列组(Si-Con组)、未处理组(空白组),Si-HULC组序列：5'-AACCTCCAGAACTGTGATCCA-3';Si-Con组序列：5'-CGAGCAGAGACTCTAACATTCTCGC-3'。

Si-HULC组、Si-Con组、空白组TPC-1细胞HULC相对表达量检测：对三组细胞进行处理，并培养48 h, 胰蛋白酶消化后将细胞裂解液置于其中，采用RT-qPCR对HULC相对表达量进行检测。

Si-HULC组、Si-Con组、空白组CCK-8法检测细胞增殖活性：采用胰蛋白酶消化三组细胞，制备单细胞悬液，与96孔板接种(2.5×105个/板),培养至细胞贴壁。分别于培养12、24、48、72、96 h时加入10 μl CCK-8,避光孵育(3 h),并对各孔A450 nm值进行检测。

Si-HULC组、Si-Con组、空白组TPC-1细胞侵袭能力检测：采用胰蛋白酶消化三组细胞，离心后分离沉淀物，采用磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered saline, PBS)反复冲洗3次，并采用血清RPMI-1640培养液制备细胞悬液(2.5×104/个/ml)。提前24 h融化基质胶，采用血清培养液进行稀释，将其置于Transwell小室上室，风干、备用。于Transwell小室上室加入200 μl细胞悬液，并将600 μl含有胎牛血清(1∶9)的RPMI1640培养液加入下室，培养24 h后取出Transwell小室，采用PBS冲洗，并采用甲醛固定，结晶紫染色，将散落细胞擦除后倒置显微镜下，随机取6个高倍镜视野对穿膜细胞进行计算，取平均值。

1.3 统计学方法

组间检验运算以统计学软件(SPSS 23.0)进行辅助，经t检验和卡方检验，对应以n)%表示，当P<0.05,则表示组间所得数据比较差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PTC组织与癌旁组织HULC相对表达量比较

PTC组织的HULC相对表达量为(2.49±0.21),癌旁组织为(1.06±0.08),PTC组织明显高于癌旁组织(t=60.369,P<0.05)。

2.2 不同临床病理特征PTC癌组织HULC相对表达量比较

年龄、性别、病灶数量、局部侵犯类型PTC癌组织HULC相对表达量比较无差异(P>0.05);肿瘤直径≤2 cm、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的PTC癌组织HULC相对表达量明显高于肿瘤直径>2 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和无淋巴结转移(P<0.05),见表1。

表1 不同临床病理特征PTC癌组织HULC相对表达量对比

2.3 三组不同培养时间段细胞增殖活性A值比较

三组12h的A值比较无差异(P>0.05);Si-HULC组24、48、72、96 h的A值明显低于Si-Con组和空白组(P<0.05),见表2。

2.4 三组HULC相对表达量、侵袭细胞数量比较

Si-HULC组HULC相对表达量明显低于Si-Con组和空白组；侵袭细胞数量明显少于Si-Con组和空白组(P<0.05),见表3。

3、讨论

PTC是甲状腺癌的多发类型，进展速度较为缓慢，仅有轻度侵袭性，早期临床症状无特异性，病灶一般只局限于甲状腺腺体内，可通过手术切除，但也有部分患者确诊时存在肿瘤突出包膜或伴有淋巴结转移的情况，仅依靠手术治疗较难完全治愈，术后复发的风险较大，极有可能缩短患者的生存期[7]。因此，尽早确诊并明确其疾病严重程度，对改善患者预后方面意义重大。一般临床主要通过超声图像中的结节形态、边界、血流情况等信息诊断甲状腺癌，虽能获取较为准确的结果，但较难对其病理类型进行判断，因此近几年临床多在超声检查的基础上联合特异性分子标记物共同诊断[8]。

近几年，有越来越多的lncRNA被发现，lncRNA作为恶性肿瘤的启动或抑制因素，对恶性肿瘤的增殖、侵袭和迁移均具有调节作用，可作为恶性肿瘤诊断的生物标记物和治疗靶点[9]。HULC是一种长度为500 nt的lncRNA,在肝癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤中均为高表达，目前也有研究认为lncRNA HULC可直接参与到肿瘤的发生与发展过程中。例如袁小笋[10]等学者的研究发现，乳腺癌组织中的HULC相对表达量明显高于正常乳腺组织，该学者认为HULC可发挥出类似癌基因的作用，从而可直接参与到乳腺癌的进展当中，是影响乳腺癌患者预后的独立危险因素。本次研究也发现，与癌旁组织相比，PTC组织中的HULC相对表达量明显更高；且不同临床病理特征比较中，肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移的HULC相对表达量比较存在显著性差异。提示HULC极有可能参与了PTC的发生与发展，且在促进PCT肿瘤生长及淋巴结转移方面也能发挥出至关重要的作用。为进一步明确HULC与PTC发生发展之间存在的关联，本次研究通过小分子RCA技术、CCK-8细胞增殖实验、Transwell侵袭实验抑制TPC-1细胞HULC的表达，结果显示，Si-HULC组24、48、72、96 h的A值相比Si-Con组和空白组明显更高；且Si-HULC组的HULC相对表达量明显比Si-Con组和空白组低，侵袭细胞数量明显比Si-Con组和空白组少。提示HULC表达在受到抑制后，TPC-1细胞的侵袭能力和增殖活性将会减弱。

表2 三组不同培养时间段细胞增殖活性A值对比

表3 三组HULC相对表达量、侵袭细胞数量对比

综上所述，HULC相对表达量与PCT肿瘤大小、分期及淋巴结转移均存在密切关联，HULC在PTC组织中的相对表达量越高，PCT肿瘤组织和淋巴结转移的风险就越大，TNM分期也会随之加高；而通过干扰HULC的表达，可对TPC-1细胞增殖活性和侵袭能力进行抑制，证明HULC有望成为PTC治疗的新靶点。

参考文献:

[1]顾华敏,胡雪芹,曹学全,等.lncRNA MIAT､LASP1蛋白在甲状腺癌组织中的表达及预后相关性分析[J].中国卫生检验杂志,2021,31(13):1584-1588.

[2]杨惠芳,汤蕊,罗雪,等.甲状腺乳头状癌细胞中长链非编码RNA FoxP4-AS1的表达及其生物学功能[J].中国普通外科杂志,2022,31(5):619-630.

[3]何亚丽,毛玉娟,申进增,等.长链非编码RNA在甲状腺乳头状癌中的表达及功能分析[J].中国临床药理学杂志,2021,37(10):1209-1213.

[4]唐悦,李杨,张荣嘉,等.lncRNA SNHG14在甲状腺乳头状癌组织中的表达及对其癌细胞增殖､迁移和侵袭的影响[J].现代肿瘤医学,2022,30(15):2727-2732.

[5]赵阳,葛雷,单中杰.lncRNA HULC在膀胱癌组织中的表达及其对5637细胞恶性生物学行为的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2021,28(1):60-66.

[6]中国抗癌协会甲状腺癌专业委员会(CATO).甲状腺微小乳头状癌诊断与治疗中国专家共识(2016版)[J].中国肿瘤临床,2016,43(10):405-411.

[7]李建华,田勇,李俊.LncRNA-POU3F3在甲状腺癌组织中的表达情况及对预后的预测价值[J].中华地方病学杂志,2021,40(7):540-544.

[8]邓家琦,况容,范宇,等.甲状腺癌免疫相关lncRNA生物标志物的生物信息学研究[J].现代免疫学,2022,42(2):104-111.