根尖周炎是一种多由牙髓及周围组织发生细菌感染所引起的根尖周组织炎症性疾病，临床根据病程发展的不同阶段可表现为患牙疼痛、咀嚼不适，严重者可伴全身症状，甚至出现张口受限、蜂窝组织炎等表现。病理学上，急性期到慢性期表现由以渗出、变质为主转变为以增生为主[1,2]，慢性炎症表现以根尖区炎性肉芽组织形成最为常见，可伴根尖周骨质破坏[3]。

根尖周炎的发生发展取决于根管内细菌及其代谢产物等引发的抗原刺激与根尖组织免疫防御系统之间的相互拮抗，细菌裂解后产生的脂多糖、内毒素、脂磷壁酸等可刺激中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、成纤维细胞等释放多种细胞因子，如白细胞介素、前列腺素、肿瘤坏死因子等，共同参与根尖周组织的破坏与修复。同时，细菌及其代谢产物作为抗原物质刺激机体产生局部免疫反应后，炎症细胞会释放大量炎症递质、细胞因子以及酶等物质参与炎症反应，影响疾病进程[4,5,6]。

白细胞介素作为在免疫应答及多种生理过程中起重要作用的一类细胞因子，在根尖周炎炎症反应过程中发挥了重要的调节作用，参与了一系列病变发展过程，如白细胞介素1、白细胞介素6等可促进炎症细胞的聚集和炎症递质的释放，而白细胞介素10可通过抑制前炎症细胞因子产生等发挥抗炎作用[7,8]。在根尖周组织和根尖周炎动物模型中均可检测出大量上述因子，同时，某些细胞因子还可通过激活破骨细胞或刺激细胞产生胶原水解酶等方式导致根尖周组织的破坏[6]。

白细胞介素24，旧称黑色素瘤分化相关基因7(MDA-7)，属于白细胞介素10超家族中的白细胞介素20R亚家族[9]，它在人体胸腺、脾脏等免疫组织器官呈现特异性表达，在某些刺激下可由一些免疫和非免疫细胞产生，如白细胞、黑色素细胞、上皮细胞、骨髓细胞以及一些肿瘤细胞(如黑素瘤细胞)等[10,11]。

白细胞介素24参与多效性免疫调节，它与其受体结合后产生的下游效应主要通过JAK/STAT和MAPK信号转导途径发生[12]，传导途径涉及协调细胞生长过程中的多种生物学功能[13]。研究表明，白细胞介素24作为炎症反应中涉及的复杂细胞因子级联反应中的一员，可诱导细胞分泌不同水平的白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等促炎细胞因子，同时还能诱导单核细胞和中性粒细胞等免疫效应细胞的目的迁移，在炎症、宿主防御、组织重塑和伤口愈合等方面与家族细胞因子共同发挥多种作用[14,15,16]。在一些骨反应性疾病中，白细胞介素24可以与破骨细胞或其前体的白细胞介素22R结合以增加单核细胞趋化蛋白1的分泌，而单核细胞趋化蛋白1会将更多表达细胞表面趋化因子受体2(CCR2)的单核细胞和破骨细胞前体募集至骨吸收区域并进一步加重炎症及骨破坏[17]。结合根尖周炎相关临床及病理特征，研究根尖周炎中白细胞介素24及其相关因子的表达水平变化以及它们本身或联合作用对根尖周炎疾病进程的影响等是非常有意义的。

目前，国内外很多学者都致力于研究免疫疗法在根尖周病治疗中的应用以及细胞因子在根尖周病发生发展中的作用，但关于白细胞介素24在根尖周炎中的相关研究尚较少。此次实验拟利用人工干预手段在小鼠口腔内诱导形成根尖周炎模型，应用组织学方法以及实时荧光定量PCR(RT-PCR)等技术，对白细胞介素24在根尖周炎病程发展不同阶段中的表达水平变化及其可能相关因素进行初步研究，为日后进一步深入讨论白细胞介素24在根尖周病中的具体作用及机制提供基本资料。

1、材料和方法

1.1 设计

小鼠口内构建诱发性根尖周炎模型。

1.2 时间及地点

于2019年3月至9月在大连医科大学实验动物中心及口内实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级6周龄C57BL/6雌性小鼠25只，体质量18-20g，健康状况可，购于大连医科大学SPF实验动物中心，许可证号：SCXK(辽)2013-0003。

主要实验仪器：立式电动牙钻机(DENTSPLY，日本)、HM525冰冻切片机(MICROM，德国)、超低温保存箱(Thermo，美国)、数显电热恒温培养箱(BOXUN，中国)、光学显微照相系统(OLYMPUS,日本)、RealtimePCR仪(TaKaRa，日本)。

主要实验试剂：DAB显色试剂盒(Solarbio，中国)、苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(中杉，中国)、白细胞介素24多克隆抗体(Biorbyt，英国)、PV-9001抗兔免疫组织化学试剂盒(中杉，中国)、Tritrol试剂盒、反转录试剂盒、TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ(TaKaRa)。

1.4 实验方法

1.4.1 建立实验动物模型

选取6周龄C57BL/6雌性小鼠25只，按随机原则平均分为5组。全麻下对实验组20只小鼠在其双侧下颌第1磨牙远中窝处开放髓腔，确保髓腔直接接触口腔自然环境，之后分别暴露于口腔7,14,21,28d，设为1周组、2周组、3周组、4周组，而对照组不予以开髓处理，设为0周组。

实验动物造模过程的相关问题

1.4.2 制备标本及冰冻切片

各组小鼠全麻后用40g/L多聚甲醛进行心脏灌注，处死后分离下颌骨并剔除多余软组织，置于40g/L多聚甲醛中4℃固定2d，然后置于10%EDTA中摇床上脱矿4周，固定时间换液。组织完全脱钙后，分别置于15%、20%蔗糖溶液中脱水各1d，之后进一步整理组织并以OCT包埋，之后用液氮速冻，标记后-80℃保存。每个标本用冷冻切片机进行近远中矢状连续切片，厚度6μm，按顺序收集待用，-80℃储存。

1.4.3 苏木精-伊红染色观察根尖周部位组织学变化

取冰冻切片37℃烤片30min,PBS室温洗3次，将苏木素滴满整张切片，确保组织完全染色3-5min(染色时间根据着色情况适当增加或减少)，流动水冲净后用60℃温水返蓝，之后将伊红染液完全覆盖组织染色1min左右，流动水冲净后置于上行梯度乙醇中完全脱干水分，再置于二甲苯中以使切片清净透明，最后在切片上滴上中性树胶，覆上盖玻片，轻压实，通风处晾干后镜下拍照。

1.4.4 RT-PCR检测根尖周部位白细胞介素24mRNA的表达

取各组小鼠下颌第1磨牙根尖组织样本，用Trizol法结合吸附柱分离纯化组织RNA，测定RNA浓度，根据TAKARA反转录试剂盒反应条件生成对应cDNA模板。

引物由上海宝生物公司设计并合成：白细胞介素24上游引物序列：GCCAAGCTTATGAATTTTCAACAGAGG，下游引物序列：GCCGTCGACCTAGAGCTTGTAGAATTT；以GAPDH为内参，其上游引物序列：AAATGGTGAAGGTCGGTGTG，下游引物序列：TGAAGGGGTCGTTGATGG。按照TBGreenTMPremixExTaqTMⅡ说明书，八连管每孔各加入25μL反应体系，混匀后放入PCR仪。采用2-∆∆Ct法比较样本mRNA的相对变化。

1.4.5 免疫组织化学(IHC)染色观察根尖周部位白细胞介素24的表达

取冰冻切片37℃烤片30min,PBS室温洗3次，将切片置于体积分数0.3%H2O2溶液中固定15min后用PBS洗3次，在组织周围画圈，用山羊血清封闭液封闭组织15min后白细胞介素24抗体(1∶500)4℃孵育过夜(<16h)；第2天切片用PBST室温洗3次，圈内组织上滴加反应增强液孵育1h,PBST清洗后再滴加增强酶抗山羊抗兔IgG聚合物孵育1h,PBST清洗后DAB发色，再用苏木精染核，流动水冲净后用60℃温水返蓝，置于上行梯度乙醇中完全脱干水分，再置于二甲苯中以使切片清净透明，最后在切片上滴上中性树胶，覆上盖玻片，轻压实，通风处晾干后镜下拍照。阳性细胞镜下显示为黄褐色。高倍镜下(400×)计数下颌第1磨牙近中根尖区域阳性细胞数，每个组织随机选取5张非连续视野进行计数后取均值。

1.5 主要观察指标

(1)根尖周病损区域白细胞介素24阳性细胞的表达量；(2)根尖周组织白细胞介素24mRNA表达高低情况。

1.6 统计学分析

通过ImagePro6.0软件进行阳性细胞数统计；相关数据统一表示为±s，通过统计分析软件SPSS20.0，运用One-wayANOVA法比较各组白细胞介素24表达情况。P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 实验动物数量分析

实验选用6周龄C57BL/6雌性小鼠25只，实验过程中无脱失，全部纳入结果分析。

2.2 苏木精-伊红染色结果

通过苏木精-伊红染色观察根尖周部位的组织学变化，以验证诱发性根尖周炎模型是否构建成功，见图1。0周组正常根尖周范围未见明显炎症反应；1周组：即开髓后暴露7d，在根尖区域组织中可见炎性细胞小范围分布，牙周膜稍见增宽，这一时期相当于处在炎症发展早期；2周组：即开髓后暴露14d，炎性细胞分布范围与炎症早期相比进一步扩大，牙槽骨边缘开始出现局部破坏，这一时期相当于处在炎症发展急性期；3周组：即开髓后暴露21d，炎细胞分布范围进一步扩大，种类多为淋巴细胞和中性粒细胞，根尖骨破坏进一步加重，炎症进入进展期；4周组：即开髓后暴露28d，炎性细胞浸润及骨破坏仍明显，局部可见纤维结缔组织形成，表明炎症逐渐进入慢性期。这表明小鼠诱发性慢性根尖周炎模型建立成功。

2.3 RT-PCR结果

通过RT-PCR检测白细胞介素24在小鼠根尖周部位mRNA表达情况，见图2。其中，各实验组根尖区组织中白细胞介素24的mRNA表达均较0周组高(P<0.05)，且也在2周达到峰值，3周及4周组中白细胞介素24的mRNA表达趋势下降，各组之间比较差异均有显著性意义(P<0.05)。

2.4 IHC染色结果

通过IHC染色检测白细胞介素24在小鼠根尖周部位中的表达情况，见图3。以根尖周区域黄褐色颗粒染色为阳性细胞，白细胞介素24阳性细胞在各时间点病灶区中均呈阳性表达。0周组正常根尖周围组织中几乎无白细胞介素24表达；各实验组根尖周区域白细胞介素24表达量较0周组明显增高(P<0.05)，且在2周组呈现表达高峰；3周组、4周组表达量较2周组有所降低。3周组与4周组两者之间差异无显著性意义，其他各组之间两两比较差异均有显著性意义(P<0.05，见图4)。

3、讨论

由牙髓及周围组织的细菌感染所引起的根尖周病变的主要特征是由于炎症及局部宿主防御反应所导致的根尖周围矿化组织破坏，疾病发展过程中细菌及其毒性产物不断侵入持续激发了宿主的免疫防御机制，这一过程涉及宿主炎性免疫应答的多个元件[18,19]。在根尖周微环境中，一些细胞因子包括白细胞介素、肿瘤坏死因子、转化生长因子等是组织破坏与重建过程中的主要调节剂，是影响炎症免疫反应的重要因素[20,21]。

有研究表明，在根尖周病变中，促炎递质和抗炎递质之间的平衡是通过调节破骨细胞生成因子核因子κB受体活化因子配体及其拮抗剂骨保护素的平衡以决定根尖周炎的发展[22,23]，但实际上，根尖周病变发展过程中所涉及的细胞因子网络要比单一的“促炎-抗炎”模式复杂得多。为了阐明由这些细胞因子介导的信号通路并促进更有效的根尖周疾病治疗策略的发展，有必要围绕一系列细胞因子进行进一步的研究。WALKER等[24]相关研究发现，在根尖周病损组织中有更多的Th2细胞，这一相对比例突显了相关炎症因子在根尖周疾病组织中的重要性。虽然调节这些免疫炎症途径的机制尚未完全阐明，但公认的是Th1和Th2样细胞因子在根尖周炎的发病机制中很重要[25]。而据报道，在T淋巴细胞家族中，白细胞介素24主要来源于Th2细胞[26]。因此作者猜测，在根尖周炎中，白细胞介素24与其他同家族细胞因子相比，可能对根尖周炎疾病进程有着更大影响。

综合以往研究，白细胞介素24可能参与机体多种疾病的相关发展，包括肿瘤以及关节炎、炎性肠病、牛皮癣、结核、病毒感染等慢性炎症和自身免疫性疾病等[27,28,29,30,31]。其中涉及炎症反应的作用机制复杂，可根据细菌感染的类型、免疫反应的细胞来源、靶标以及疾病不同阶段的变化而变化。譬如在上皮组织感染的炎症过程中，白细胞介素24通过诱导抗菌肽如S100家族蛋白、钙卫蛋白亚基S100A8和S100A9等因子的产生以及促进炎症部位白细胞的募集和激活来诱导上皮组织的先天免疫应答，并恢复组织稳态。同时白细胞介素24会通过刺激角质形成细胞表达募集巨噬细胞和其他白细胞的趋化因子和细胞因子来加速伤口愈合过程中的炎症反应[32,33]。当金黄色葡萄球菌感染皮肤后，早期宿主防御反应依赖于上皮细胞产生的白细胞介素1β和白细胞介素17等所引起的中性粒细胞募集，当白细胞介素24被金黄色葡萄球菌局部诱导后，则会抑制白细胞介素1β和白细胞介素17的产生，导致更严重的炎症与感染以及中性粒细胞募集减少[9,34,35]。

此外，白细胞介素24在一些炎性溶骨性疾病中具体发挥怎样的调控机制逐渐成为近年来的研究热点。有学者在早期类风湿关节炎组织的破骨细胞上发现了白细胞介素20、白细胞介素22和白细胞介素24的共有亚基白细胞介素22RA1，后续研究证实白细胞介素22RA1对于骨稳态的维持很重要[36]。KRAGSTRUP等[37]研究表明，白细胞介素24可以通过在脊柱关节病中使滑液单核细胞活化以增加单核细胞趋化蛋白1/CCL2的分泌，CCL2进一步募集更多的单核细胞及破骨细胞至关节以维持慢性炎症并产生骨破坏，同时白细胞介素24能减少脊柱关节病滑膜成纤维细胞分泌Dickkopf-1并诱导人成骨细胞矿化，白细胞介素24通过直接或间接机制参与慢性炎症及骨反应过程，从而导致疾病的加重。

此次实验提出白细胞介素10家族成员白细胞介素24参与了根尖周炎的发生发展过程，通过在小鼠口腔内诱导建立根尖周炎模型，利用IHC等组织学方法，结合RT-PCR等手段，对白细胞介素24在根尖周炎病程发展不同阶段中的表达水平变化进行了初步探讨，从而为后期进一步明确白细胞介素24与炎症和骨破坏之间的关系奠定基础。研究发现，在诱发性根尖周炎动物模型中，白细胞介素24表达增高且随病变发展有一定趋势。开髓后1周，根尖区有轻度炎症表现，这一阶段由牙髓感染所产生的毒性物质通过根尖孔扩散至根尖周组织引发一系列免疫炎症反应；开髓后2周，根尖周区域炎症范围快速蔓延扩大，大量中性粒细胞聚集，根尖周血管扩张充血，炎症进入急性期；开髓后3,4周，根尖周病变逐渐进入慢性发展阶段，炎症范围逐渐扩大，根尖周组织结构不断破坏，可见炎性灶形成，周围纤维结缔组织增生，其中淋巴细胞、巨噬细胞等散在浸润。在这一过程中，发现小鼠根尖病损区域的白细胞介素24阳性表达水平明显高于正常组织且在开髓后2周组织中表达呈现峰值，三四周后表达开始逐渐降低，其中3周组与4周组两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测根尖周病损组织中白细胞介素24的mRNA表达情况与上述组织学结果大体趋势保持一致，表达也在2周组织中出现高峰，各组之间比较差异均有显著性意义(P<0.05)。对于3,4周组在基因和蛋白水平上表达的差异，考虑将其归因于转录及翻译过程中的不可控因素干扰。

白细胞介素24在不同疾病中发挥促炎作用的机制可以概括为以下2个方面：一是通过诱导不同的细胞分泌不同水平的促炎细胞因子，二是通过某种机制发挥对单核细胞和中性粒细胞等免疫效应细胞的募集作用，使其向感染部位聚集[38,39,40]。有研究表明，在小鼠伤寒模型中，白细胞介素24通过刺激中性粒细胞产生IFN-γ、白细胞介素12和一氧化氮来激活CD8+T细胞，从而提高宿主对体内沙门氏菌感染的抵抗力[41]。此次实验中，白细胞介素24在2周时出现表达高峰，此时根尖周炎处于急性进展期，大量中性粒细胞聚集。考虑白细胞介素24本身的促炎机制以及以往骨反应疾病研究中白细胞介素24对巨噬细胞及破骨细胞的吸引作用，推测在根尖周炎急性期，白细胞介素24很有可能通过募集或调控中性粒细胞产生某些促炎因子加速了根尖周炎的炎症发展，同时，白细胞介素24很可能在骨破坏发生早期发挥重要作用，当根尖周炎症状态不再持续、骨破坏趋于稳定后，白细胞介素24表达即呈现下降趋势。此次实验的不足在于未具体研究白细胞介素24与根尖周炎进展过程中骨破坏之间的关系，也未具体分析其与中性粒细胞及破骨细胞之间的关系，这些将在今后的研究中进一步完善。

综上，作者得出结论，白细胞介素24与根尖周炎的炎症进展密切相关，参与了根尖周炎的发生发展过程，其在根尖周炎炎症或骨组织破坏等其他一系列进展中的具体作用机制仍需后期更深入地探讨。结合以往诸多学者对白细胞介素24及涉及的复杂细胞因子网络在炎症及骨平衡中的相关研究考虑，有必要在日后开展更多的研究来充分认识这一系列细胞因子的多种生物学功能，进一步认清它们在根尖周疾病中作用机制，以促进全新或更有效的治疗策略发展。

张咪,吴赛璇,董明,陆颖,牛卫东.根尖周炎模型小鼠白细胞介素24的表达[J].中国组织工程研究,2021,25(05):679-684

基金:国家自然科学基金(81700962),项目负责人:陆颖..