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“红色复合体”致病菌裂解液对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响

2020-09-18 389 上传者：管理员

摘要：目的:探讨“红色复合体”牙周致病菌裂解液对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响。方法:收集因正畸需要而拔除的健康前磨牙,原代培养人牙周膜干细胞(hPDLCs);采用免疫荧光方法和成骨分化诱导实验对培养的原代hPDLCs进行鉴定;体外联合培养牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌,建立“红色复合体”模型,扫描电镜对其进行鉴定;制备“红色复合体”裂解液,通过碱性磷酸酶试剂盒、实时定量PCR、茜素红染色,检测裂解液对hPDLCs碱性磷酸酶活性,成骨分化相关基因表达的影响;以及对hPDLCs成骨矿化能力的影响。结果:在“红色复合体”裂解液的刺激下,hPDLCs碱性磷酸酶活性,成骨分化相关基因ALP、Runx2、OPN、COL1的表达以及成骨矿化水平显著降低。结论:“红色复合体”牙周致病菌能够抑制hPDLCs的成骨分化能力。

关键词：
口腔医学
成骨分化能力
牙周膜细胞
牙周致病菌
红色复合体
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牙周病是由牙周致病菌感染导致的牙周组织炎症性疾病,牙周组织的破坏与丢失是其主要临床特征[1]。牙龈卟啉单胞菌,齿垢密螺旋体和福赛斯坦纳菌,即“红色复合体”,是世界牙周病研讨会公认的导致牙周病的最主要牙周致病菌群[2]。研究表明,大部分口腔致病菌在龈下菌斑中不是单独存在,而是以复合体的形式被发现。致病菌在龈下菌斑内共聚,互相支持营养,互相调节毒力因子,形成协同致病性,以协同的方式导致牙周病[3]。

通过组织工程学方法利用干细胞对破损牙周组织进行修复与重建,从而恢复牙周组织的功能有望代替传统疗法来治愈牙周病,而干细胞的使用是这一方法的核心。牙周膜是位于牙槽骨和牙骨质之间的致密结缔组织,由多种类型的细胞群组成,包括成牙骨质细胞、成骨细胞、成纤维细胞和未分化的间充质细胞[4]。2004年Seo等[5]首次通过酶组织块消化法从离体牙的牙周膜细胞群中成功分离培养出一种新的独特的干细胞,具有良好的干细胞特性以及具有再生牙骨质和牙周膜样组织的特点。人牙周膜干细胞(hPDLCs)具有多向分化潜能,并且取材方便,已成为牙周再生领域的研究热点。尽管应用组织工程学方法利用牙周膜细胞在动物模型上已经能够进行部分牙组织再生,但是距离临床上完整进行牙组织再生的目标还相差甚远[6]。其主要原因在于目前对于调控牙周膜细胞多向分化潜能的分子机制研究还不够深入;并且,在牙周病患者牙周组织中存在大量的牙周致病菌,即便行手术治疗,临床上也不能达到完全无菌的效果[7],因此通过组织工程学方法植入牙周破损处的牙周膜细胞仍然会持续受到口腔致病菌的作用,尤其是“红色复合体”及其毒力因子的影响。因此,了解hPDLCs在“红色复合体”致病菌裂解液的作用下,其成骨分化能力的改变情况,对于通过组织工程学方法利用牙周膜细胞获得完全的牙周组织再生具有重要指导意义。

1、材料与方法

1.1材料

细菌菌株购买于美国ATCC;试剂盒购买于上海生工生物工程股份有限公司;其他试剂均购买于美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1hPDLCs原代培养

收集12～14岁因正畸需要拔除的健康前磨牙,本方案经西南医科大学附属口腔医院伦理委员会批准(201909120)。用含双抗(100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)的PBS多次漂洗,刮取根中1/3牙周膜组织。利用组织块酶消化法原代培养牙周膜细胞[8]。

1.2.2免疫荧光实验

将第3代hPDLCs接种于细胞爬片上,待细胞生长汇合至50%～60%,4%多聚甲醛固定20min,0.25%TritonX-100处理15min,10%山羊血清37℃封闭30min,37℃孵育一抗波形蛋白(1∶300)和角蛋白(1∶500)1h,PBS洗涤,37℃避光孵育荧光二抗(1∶200)1h,DAPI染细胞核1min,封片,荧光显微镜下观察。

1.2.3“红色复合体”致病菌的培养及裂解液的制备

Pg(ATCC33277)生长于含有0.5mg/L维生素K1和5mg/L氯化血红素的BHI培养基中;Td(ATCC33521)生长于含有10%兔血清的TYGVS培养基中;Tf(ATCC43037)生长于含有10%热马血清和15g/LN-乙酰胞壁酸的PY培养基中。37℃缺氧小室(85%N2、10%H2和5%CO2)培养3～5d。细菌单独培养至对数生长期,将3种细菌以1∶1∶1体积混合,于含有10%热失活兔血清的TYGVS培养基中,共同培养3d。离心收集细菌沉淀,PBS漂洗后重悬浮细菌,将混合液置冰浴中,用超声波细胞破碎仪间断破壁处理20min,离心(20000g,20min4℃)收集上清,BCA法测定蛋白浓度备用。

1.2.4扫描电镜鉴定细菌样本

取生长状态良好的联合培养细菌,离心收集细菌沉淀,PBS漂洗后取少量悬浮菌液滴载玻片上,室温干燥,2.5%戊二醛4℃固定过夜,PBS漂洗,梯度乙醇脱水,真空冷冻干燥机干燥过夜,采用场发射扫描电镜观察细菌形态。

1.2.5hPDLCs增殖检测

将hPDLCs(1×104个细胞/孔)接种于96孔板内并加入不同浓度的裂解液,培养48h后,用CellViabilityAssay试剂盒(Promega,美国)检测相对细胞数。简述如下:弃去培养液,每孔中加入15μL染色液孵育4h,再加入100μL中止液。酶标仪检测650nm处A值。实验至少重复3次。

1.2.6实时定量PCR

将细菌裂解液(100g/L)感染细胞和正常细胞,Trizol法提取总RNA,分光光度计检测RNA的浓度和纯度。以总RNA为模板,使用反转录试剂盒合成cDNA,PCR检测ALP、Runx2、OPN以及COL1基因的表达。反应条件:95℃5min,95℃10s,60℃30s循环40次。引物序列见表1。

1.2.7hPDLCs体外成骨分化诱导及矿化染色半定量分析

第3代hPDLCs细胞,接种于6孔板中,待细胞至70%左右融合时,加入成骨诱导液进行成骨诱导。对照组细胞只加入成骨诱导液,实验组细胞加入含有100mg/L细菌裂解液的成骨诱导液。每隔2d换液1次,诱导21d后,PBS漂洗,4%多聚甲醛固定30min,PBS漂洗,加入茜素红染色液30min,PBS漂洗,倒置显微镜下观察。矿化染色半定量分析:吸干培养皿中液体,每孔加入0.5mL5%SDS-HCL染色洗脱液,室温摇床摇晃30min,每组吸150μL转移到96孔板,使用酶标仪在620nm波长检测A值。

表1引物序列

1.2.8碱性磷酸酶(ALP)活性检测

取第3代hPDLCs细胞接种于培养皿,待细胞至70%左右融合时,加入含有100mg/L细菌裂解液的成骨诱导液进行成骨诱导,每隔2d换液1次,诱导14d。收集细胞,用1%TritonX-100裂解细胞,反复吹打后冰浴30min,离心15min(12000rpm,4℃),取上清,用BCA法检测蛋白浓度。按照ALP活性检测试剂盒说明书,使用酶标仪在405nm波长检测每孔的A值。

1.2.9统计学分析

利用GraphPadPrism6软件进行统计学分析。数据分析x±s采用t检验(studentt-test),以P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1hPDLCs原代培养与鉴定

hPDLCs经原代培养7d后,可见细胞呈放散状爬出,大部分呈长梭形,均为典型的间充质成纤维样(图1a)。免疫荧光染色鉴定,细胞表达波形蛋白;不表达角蛋白(图1b,图1c)。hPDLCs经化学成骨诱导21d后,茜素红染色可见大量矿化结节(图1d)。

2.2电镜下“红色复合体”致病菌的形态

通过电镜对Pg、Td、Tf3种致病菌的形态进行观察。结果显示,单独培养条件下的Pg呈球状(图2a),Td呈细螺旋状(图2b),Tf呈短杆状(图2c)。在联合培养条件下,3种致病菌紧密结合在一起,但形态没有变化(图2d)。

2.3“红色复合体”细菌裂解液对hPDLCs增殖的影响

与对照组(0.79±0.04)相比,1mg/L裂解液(0.80±0.06)对hPDLCs增殖无明显影响,而10mg/L(0.69±0.03)和100mg/L裂解液(0.52±0.03)能明显抑制hPDLCs的增殖,而且这种抑制作用随其浓度的增加而增强,差异具有统计学意义(P<0.01)。

2.4“红色复合体”细菌裂解液对hPDLCs的ALP活性及成骨分化相关基因表达的影响

为了研究“红色复合体”细菌裂解液对hPDLCs成骨分化特性的影响,本文检测了hPDLCs的ALP活性的变化。与未成骨诱导的细胞(1.00±0.11)相比,经成骨诱导的hPDLCs(阳性对照组)在诱导的第14天,ALP活性显著增高(12.15±0.55)。与此阳性对照组相比较,细菌裂解液(100mg/L)明显抑制了ALP的活性(0.70±0.35),差异具有统计学意义(P<0.05)。其次,本文检测了hPDLCs成骨分化相关基因的表达。与对照组细胞相比较,细胞经细菌裂解液(100mg/K)刺激24h后,ALP、RUNX2、OPN以及COL1的基因表达水平明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

图1hPDLCs的原代培养及鉴定

图2“红色复合体”致病菌扫描电镜图

表2“红色复合体”细菌裂解液对hPDLCs成骨分化相关基因表达的影响

2.5“红色复合体”细菌裂解液对hPDLCs成骨矿化水平的影响

hPDLCs经成骨诱导21d后,经茜素红染色可见大量红色矿化结节。与阳性对照组相比较,在细菌裂解液(100mg/L)刺激下,hPDLCs形成矿化结节的数量显著降低(图3)。矿化洗脱液半定量分析表明,与单纯成骨诱导组相比较,在细菌裂解液刺激下,细胞的成骨矿化能力降低了34.37%。

图3红色复合体”细菌裂解液对hPDLCs成骨矿化水平的影响

3、讨论

自2004年Seo等首次通过酶组织块消化法原代培养出hPDLCs以来,由于其具有良好的干细胞特性以及能再生牙骨质和牙周膜样组织的特点,近年来得到了越来越多学者的关注。本研究中的hPDLCs提取于因正畸需要而拔除的健康前磨牙,经原代培养后具有典型的间充质干细胞形态,其表达间充质干细胞标记物-波形蛋白,不表达上皮细胞标记物-角蛋白,证明其是纯化的hPDLCs。hPDLCs是来源于牙周膜组织的间充质干细胞,具有较强的成骨分化潜能。本文所培养的原代hPDLCs在化学成骨诱导后,经茜素红染色可见大量的成骨矿化结节,这与以往相关的报道一致。

通过组织工程学方法,应用hPDLCs对牙周损伤组织进行修复与重建依赖于其较强的成骨分化能力,因此任何不利于其成骨分化的因素都会影响其最终修复牙周损伤组织的效率。牙周病患者龈下菌斑中存在大量牙周致病菌,尤其是“红色复合体”。脂多糖是“红色复合体”牙周致病菌的主要致病因子。研究人员Kato等[9]和Yu等[10]报道脂多糖可以抑制牙周膜细胞的成骨分化能力,在脂多糖的刺激下,牙周膜细胞ALP活性、成骨分化相关基因的表达水平以及成骨矿化能力均明显降低。而Albiero等[11]报道脂多糖对PDLCs的成骨分化能力并没有影响。目前关于“红色复合体”对hPDLCs成骨分化能力影响的研究鲜有报道,谭咏梅等[12]利用Pg与牙周膜细胞共同培养,发现牙周膜细胞的Runx2基因表达明显下调,且其矿化结节的形成数量明显低于对照组。“红色复合体”是由Pg、Td和Tf三种牙周致病菌组成,包含多种毒力因子,如菌毛、牙龈素、细胞外膜蛋白、脂多糖等,其致病机制远比脂多糖或者单种致病菌更加复杂。“红色复合体”超声裂解液的致病成分与“红色复合体”牙周致病菌相类似,因此,研究人员常用其裂解液来研究“红色复合体”的致病作用。为了观察“红色复合体”对hPDLCs成骨分化能力的影响,本文首先检测了“红色复合体”裂解液对hPDLCs的ALP活性以及成骨分化相关基因ALP、RUNX2、OPN、COL1表达的影响。原代培养的hPDLCs在成骨分化的过程中表达成骨相关蛋白,这些特异性蛋白是区分成骨分化不同阶段的标记物,其中,ALP、RUNX2、OPN、COL1是最典型的骨分化蛋白标记物。RUNX2是成骨分化过程中最重要的基因调控蛋白,负责成骨标记蛋白相关基因的激活[13]。COL1是细胞外基质的重要组成成分,是成骨分化最早期的标记物[14]。ALP与细胞外基质的矿化有关,是细胞外基质开始矿化的标志[15]。因此,COL1、ALP和RUNX2是成骨分化的早期标记物。而OPN是细胞外基质矿化成熟的标志,是成骨分化晚期的标记物。本实验结果显示,在“红色复合体”裂解液刺激下,hPDLCs的ALP活性以及成骨分化相关基因ALP、RUNX2、OPN、COL1表达水平明显受到抑制。上述实验数据结果表明“红色复合体”裂解液能够抑制hPDLCs的成骨分化过程。为了进一步验证“红色复合体”裂解液对hPDLCs成骨分化能力的影响,本文检测了致病菌裂解液对hPDLCs成骨矿化能力的影响。结果表明,致病菌裂解液对hPDLCs的成骨矿化能力有明显的抑制作用。因此得出结论,“红色复合体”致病菌能够抑制hPDLCs的成骨分化能力。

参考文献：

[8]杨芳,陈明月,胡英英,等.PPARγ在脂多糖刺激牙周膜细胞中调控NF-κB信号通路的作用研究[J].口腔医学研究,2017,33(7):698-702.

[12]谭咏梅,侯晋,杨小军,等.侵入细胞内的牙龈卟啉单胞菌影响人牙周膜细胞的增殖及成骨分化[J].南方医科大学学报,2016,36(4):525-531.

周何洁,李胜鸿,彭培钊,唐榕,李艾莲,曾锦.“红色复合体”致病菌裂解液对人牙周膜细胞成骨分化能力的影响[J].口腔医学研究,2020,36(09):839-843.

基金:四川省泸州市科技局应用基础研究项目(编号:2019-JYJ-55);国家级大学生创新创业训练计划项目(编号:201816032053);西南医科大学重点项目(编号:2017-ZRZD-001).