摘要:目的:探讨低分子量的透明质酸(HA)对人间充质干细胞(hMSCs)增殖及成骨方向分化的影响。方法:本实验选用NanoHA(分子量为3~6Da的HA)及150KHA(分子量为150kDa的HA)对hMSCs进行刺激。实验分组:空白对照组、阳性对照组(成骨诱导+OS组)、NanoHA组(OS+NanoHA)和150KHA组(OS+150KHA)。每周观察细胞形态及增殖情况、收样进行rt-PCR,共3周。第21d时进行细胞钙沉积实验。结果:2个HA实验组的细胞增殖速度较快,形态由长梭形或多角形变为圆形或椭圆形,21d可见类似骨样圆形结构形成,并有少量黑色沉积。NanoHA组较2个对照组的细胞增殖显著增快(均P<0.01)。150KHA组较空白对照组增殖显著增快(P<0.01)。第3d、7d时NanoHA组比阳性对照组表达更多的ALP(均P<0.05)。第21d时,2个HA实验组都比阳性对照组有更高的ALP表达(P<0.05,P<0.01);150kHA组比NanoHA组显著增高(P<0.01)。钙沉积量按多少排序为Nano HA组>150k HA组>阳性对照组>空白对照组。结论:低分子量HA可促进hMSCs增殖及成骨分化,尤其Nano HA可以增加细胞的钙沉积量。
慢性牙周炎是牙齿周围支持组织的常见病,且与各种系统性疾病如冠心病,糖尿病等密切相关甚至相互促进[1,2],因此积极治疗牙周病非常有必要。目前牙周病的治疗主要在于菌斑控制[3]而对促进牙周再生上有所欠缺。低分子量透明质酸(HA)有抗炎,促进组织再生的作用,在临床上应用广泛[4],而其对慢性牙周炎的作用待研究。
1、材料和方法
1.1 材料
选择牙周组织中广泛存在的人间充质干细胞(hMSCs):购入原代细胞(Lonza公司)后分离培养,传代至第5、6代后用于本次实验。成骨诱导(OS)液由地塞米松、β-甘油磷酸盐、抗坏血酸等加入培养基配成,具体配方见表1。
HA来自HYALOSE公司。选择分子量3~6Da的NanoHA及分子量150kDa的HA进行实验,每次实验用浓度为20ng/ml[5,6]。
1.2 实验方法
共分为空白对照组、阳性对照组(OS组)、NanoHA(OS+NanoHA)组和150KHA(OS+150KHA)组。
hMSCs细胞在37℃、5%CO2的恒温箱中培养,每周换液2次。每周同一时间显微镜拍照进行细胞形态学观察。细胞增殖WST-1检测:将hM-SCs均匀种在4盒48孔培养皿中,等待48h,细胞完全附着生长后,标记为起点,分别在第0d、7d、14d、21d进行细胞增殖。WST-1试剂盒来自Roche公司,加入培养皿30min后,将细胞进行ELISA测试。
rt-PCR:将hMSCs均匀种在6孔培养皿中,等待48h,细胞完全附着生长后,标记为起点,分别在第0d、7d、14d、21d刮取细胞,提取RNA,转化为cDNA后,进行rt-PCR试验。管家基因选用GAPDH(searchLC,Heidelberg公司)。检测标记物为早期成骨标记物碱性磷酸酶(ALP)及末期成骨标记物骨钙蛋白(OCN)。
钙沉积定量检测:将hMSCs均匀种在T-25培养皿中,培养21d后分离刮取细胞,使用QuantiChromTM钙沉积试剂盒,加入试剂后进行ELISA测试。
1.3 统计学方法
应用Prism8.0进行统计学分析。两两比较采用t检验,组间比较采用one-wayANOVA。
2、结果
2.1 HA成骨诱导及形态学观察
由图1可见,空白对照组中hMSCs呈梭形或多角形,集落状生长,随着培养时间的增加,集落逐渐融合,细胞均匀聚集分布(图A1~A3)。B组为成骨诱导的阳性对照组,第7d起hMSCs多呈圆形或椭圆形,第21d可见类似骨样圆形结构形成(B3中箭头所指),并有少量黑色矿物质沉积。C组为NanoHA实验组,细胞形态与B组类似,第21d时亦可观察到有类似骨样圆形结构形成,并有比B组更多的黑色矿物质沉积(C3中箭头所指)。D组为150KHA实验组,hMSCs与B组类似,第14d即有较C组更明显的骨样组织形成(D2),第21d时骨样圆形结构黑色矿物质沉积与C组类似(D3)。
2.2 HA刺激hMSCs增殖
图2示,实验初期各组细胞生长速度接近,第14d时,各组细胞生长速度开始略有不同,但各组内并无统计学差异。第21d时,NanoHA组较空白对照组细胞增殖显著增快(P<0.01),较OS组亦较快(P<0.01)。150KHA组较空白对照组增速较快(P<0.01)。2种分子量HA对细胞增殖无统计学差异,OS组与空白对照组间亦无统计学差异。
2.3 rt-PCR中ALP、OCN的表达
图3示,ALP在hMSCs中的表达在前7d随着时间增加而增加,21d时均有所下降。在实验的第3d、7dNanoHA组比OS组表达更多的ALP(均P<0.05)。第21d,Nano和150kHA组都比阳性对照组有更高的表达(P<0.05,P<0.01);150k比NanoHA组显著增高(P<0.01)。空白对照组在每个时间点均比同期的其他实验组的ALP表达要低。各组内第3d、7d和21d时ALP的表达均有统计学差异(均P<0.01)。
图4中OCN表达可见与ALP的表达类似,前7d随着时间增加而增加,到21d时均有所下降。第3d、7dNanoHA组的OCN表达显著高于OS组(均P<0.01)。150kHA组表达与阳性对照组无统计学差异。第3d、7d和21d时组内OCN的表达均有统计学差异(均P<0.01)。
2.4 钙沉积实验结果
图5示,21d时HA对hMSCs成骨分化有促进作用,尤以NanoHA为甚。
HA实验组钙沉积量均显著高于空白对照组(均P<0.01),提示HA可刺激hMSCs成骨的分化。2种分子量的HA均有显著的刺激成骨的作用,NanoHA及150KHA组的钙沉积量均显著高于阳性对照组(均P<0.01)。此外,NanoHA对细胞成骨的刺激显著高于150KHA组(P<0.05)。钙沉积量按多少排序为:Nano组>150k组>OS组>空白对照组。
3、讨论
HA由于其低细胞毒性、低抗原性、低致敏性,临床上在美容、关节软骨、关节炎治疗等方面已经广泛临床应用[7,8]。高分子量HA对大部分细胞有抑制增殖的作用[9]。而低分子量HA则相反,其刺激细胞增殖,本实验结果亦验证了这一结果。在d21时NanoHA及150KHA促进hMSCs增殖。ALP是成骨分化早期的标志物,细胞内ALP表达增高表明成骨的增加[10]。本实验中2种HA都能提高hMSCs的ALP的表达,150kDaHA比NanoHA要更强。唾液中的OCN含量与牙周炎的严重程度不相关[11],但却是成骨晚期的标记物[12]。本实验中150kDaHA对OCN似乎没有影响,而NanoHA可以提高hMSCs的OCN表达。钙沉积实验中,成骨诱导及低分子量HA的加入较空白对照组均能显著增加钙沉积物,尤其是NanoHA可以显著增加细胞中钙的含量。总之,低分子量HA的加入可以刺激hMSCs成骨方向的分化。
HA可诱导受损组织中成纤维细胞和角质细胞分化以修复受损伤的组织[13],还可以在炎症状态下激活组织免疫反应[14],对于牙周炎这种慢性炎症应用前景广泛。此外HA还可以诱导软骨及韧带的修复[15]。后期对于牙周再生起重要作用的hMSCs成软骨及成纤维分化将进一步研究。
文章来源:金洁琪,光梦凯.低分子量透明质酸对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响[J].中日友好医院学报,2021,35(06):339-343.
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