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低分子量透明质酸对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响
摘要：目的:探讨低分子量的透明质酸(HA)对人间充质干细胞(hMSCs)增殖及成骨方向分化的影响。方法:本实验选用NanoHA(分子量为3～6Da的HA)及150KHA(分子量为150kDa的HA)对hMSCs进行刺激。实验分组:空白对照组、阳性对照组(成骨诱导+OS组)、NanoHA组(OS+NanoHA)和150KHA组(OS+150KHA)。每周观察细胞形态及增殖情况、收样进行rt-PCR,共3周。第21d时进行细胞钙沉积实验。结果:2个HA实验组的细胞增殖速度较快,形态由长梭形或多角形变为圆形或椭圆形,21d可见类似骨样圆形结构形成,并有少量黑色沉积。NanoHA组较2个对照组的细胞增殖显著增快(均P<0.01)。150KHA组较空白对照组增殖显著增快(P<0.01)。第3d、7d时NanoHA组比阳性对照组表达更多的ALP(均P<0.05)。第21d时,2个HA实验组都比阳性对照组有更高的ALP表达(P<0.05,P<0.01);150kHA组比NanoHA组显著增高(P<0.01)。钙沉积量按多少排序为Nano HA组>150k HA组>阳性对照组>空白对照组。结论:低分子量HA可促进hMSCs增殖及成骨分化,尤其Nano HA可以增加细胞的钙沉积量。
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慢性牙周炎是牙齿周围支持组织的常见病，且与各种系统性疾病如冠心病，糖尿病等密切相关甚至相互促进[1,2]，因此积极治疗牙周病非常有必要。目前牙周病的治疗主要在于菌斑控制[3]而对促进牙周再生上有所欠缺。低分子量透明质酸（HA）有抗炎，促进组织再生的作用，在临床上应用广泛[4]，而其对慢性牙周炎的作用待研究。
1、材料和方法
1.1 材料
选择牙周组织中广泛存在的人间充质干细胞（hMSCs）：购入原代细胞（Lonza公司）后分离培养，传代至第5、6代后用于本次实验。成骨诱导（OS）液由地塞米松、β-甘油磷酸盐、抗坏血酸等加入培养基配成，具体配方见表1。
HA来自HYALOSE公司。选择分子量3～6Da的NanoHA及分子量150kDa的HA进行实验，每次实验用浓度为20ng/ml[5,6]。
1.2 实验方法
共分为空白对照组、阳性对照组（OS组）、NanoHA(OS+NanoHA）组和150KHA(OS+150KHA）组。
hMSCs细胞在37℃、5%CO2的恒温箱中培养，每周换液2次。每周同一时间显微镜拍照进行细胞形态学观察。细胞增殖WST-1检测：将hM-SCs均匀种在4盒48孔培养皿中，等待48h，细胞完全附着生长后，标记为起点，分别在第0d、7d、14d、21d进行细胞增殖。WST-1试剂盒来自Roche公司，加入培养皿30min后，将细胞进行ELISA测试。
rt-PCR：将hMSCs均匀种在6孔培养皿中，等待48h，细胞完全附着生长后，标记为起点，分别在第0d、7d、14d、21d刮取细胞，提取RNA，转化为cDNA后，进行rt-PCR试验。管家基因选用GAPDH(searchLC,Heidelberg公司）。检测标记物为早期成骨标记物碱性磷酸酶（ALP）及末期成骨标记物骨钙蛋白（OCN）。
钙沉积定量检测：将hMSCs均匀种在T-25培养皿中，培养21d后分离刮取细胞，使用QuantiChromTM钙沉积试剂盒，加入试剂后进行ELISA测试。
1.3 统计学方法
应用Prism8.0进行统计学分析。两两比较采用t检验，组间比较采用one-wayANOVA。
2、结果
2.1 HA成骨诱导及形态学观察
由图1可见，空白对照组中hMSCs呈梭形或多角形，集落状生长，随着培养时间的增加，集落逐渐融合，细胞均匀聚集分布（图A1～A3）。B组为成骨诱导的阳性对照组，第7d起hMSCs多呈圆形或椭圆形，第21d可见类似骨样圆形结构形成（B3中箭头所指），并有少量黑色矿物质沉积。C组为NanoHA实验组，细胞形态与B组类似，第21d时亦可观察到有类似骨样圆形结构形成，并有比B组更多的黑色矿物质沉积（C3中箭头所指）。D组为150KHA实验组，hMSCs与B组类似，第14d即有较C组更明显的骨样组织形成（D2），第21d时骨样圆形结构黑色矿物质沉积与C组类似（D3）。
2.2 HA刺激hMSCs增殖
图2示，实验初期各组细胞生长速度接近，第14d时，各组细胞生长速度开始略有不同，但各组内并无统计学差异。第21d时，NanoHA组较空白对照组细胞增殖显著增快（P<0.01），较OS组亦较快（P<0.01）。150KHA组较空白对照组增速较快（P<0.01）。2种分子量HA对细胞增殖无统计学差异，OS组与空白对照组间亦无统计学差异。
2.3 rt-PCR中ALP、OCN的表达
图3示，ALP在hMSCs中的表达在前7d随着时间增加而增加，21d时均有所下降。在实验的第3d、7dNanoHA组比OS组表达更多的ALP（均P<0.05）。第21d,Nano和150kHA组都比阳性对照组有更高的表达（P<0.05,P<0.01);150k比NanoHA组显著增高（P<0.01）。空白对照组在每个时间点均比同期的其他实验组的ALP表达要低。各组内第3d、7d和21d时ALP的表达均有统计学差异（均P<0.01）。
图4中OCN表达可见与ALP的表达类似，前7d随着时间增加而增加，到21d时均有所下降。第3d、7dNanoHA组的OCN表达显著高于OS组（均P<0.01）。150kHA组表达与阳性对照组无统计学差异。第3d、7d和21d时组内OCN的表达均有统计学差异（均P<0.01）。
2.4 钙沉积实验结果
图5示，21d时HA对hMSCs成骨分化有促进作用，尤以NanoHA为甚。
HA实验组钙沉积量均显著高于空白对照组（均P<0.01），提示HA可刺激hMSCs成骨的分化。2种分子量的HA均有显著的刺激成骨的作用，NanoHA及150KHA组的钙沉积量均显著高于阳性对照组（均P<0.01）。此外，NanoHA对细胞成骨的刺激显著高于150KHA组（P<0.05）。钙沉积量按多少排序为：Nano组>150k组>OS组>空白对照组。
3、讨论
HA由于其低细胞毒性、低抗原性、低致敏性，临床上在美容、关节软骨、关节炎治疗等方面已经广泛临床应用[7,8]。高分子量HA对大部分细胞有抑制增殖的作用[9]。而低分子量HA则相反，其刺激细胞增殖，本实验结果亦验证了这一结果。在d21时NanoHA及150KHA促进hMSCs增殖。ALP是成骨分化早期的标志物，细胞内ALP表达增高表明成骨的增加[10]。本实验中2种HA都能提高hMSCs的ALP的表达，150kDaHA比NanoHA要更强。唾液中的OCN含量与牙周炎的严重程度不相关[11]，但却是成骨晚期的标记物[12]。本实验中150kDaHA对OCN似乎没有影响，而NanoHA可以提高hMSCs的OCN表达。钙沉积实验中，成骨诱导及低分子量HA的加入较空白对照组均能显著增加钙沉积物，尤其是NanoHA可以显著增加细胞中钙的含量。总之，低分子量HA的加入可以刺激hMSCs成骨方向的分化。
HA可诱导受损组织中成纤维细胞和角质细胞分化以修复受损伤的组织[13]，还可以在炎症状态下激活组织免疫反应[14]，对于牙周炎这种慢性炎症应用前景广泛。此外HA还可以诱导软骨及韧带的修复[15]。后期对于牙周再生起重要作用的hMSCs成软骨及成纤维分化将进一步研究。
文章来源：金洁琪,光梦凯.低分子量透明质酸对人间充质干细胞增殖及成骨分化的影响[J].中日友好医院学报,2021,35(06):339-343.
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期刊名称：牙体牙髓牙周病学杂志
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主管单位：第四军医大学
主办单位：第四军医大学口腔医学院
出版地方：陕西
专业分类：医学
国际刊号：1005-2593
国内刊号：61-1254/R
邮发代号：52-128
创刊时间：1991年
发行周期：月刊
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