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茶黄素-3,3′-双没食子酸酯机制及对骨质疏松的作用研究

2020-08-19 200 上传者：管理员

摘要：目的：探究茶黄素-3,3′-双没食子酸酯（theaflavin-3,3′-digallate,TF3）对骨质疏松的作用及其机制。方法：建立小鼠去卵巢（OVX）骨质疏松模型，注射剂量为1mg/kg和10mg/kg的TF3,3个月后取股骨进行微型CT(Micro-CT）分析。体外应用过氧化氢（H2O2）建立MC3T3-E1细胞氧化应激模型，并分别加入0、1、10μmol/L的TF3，检测TF3对细胞活性、细胞内活性氧（ROS）含量和抗氧化基因表达的影响。结果：Micro-CT分析结果表明，TF3能降低骨质疏松的骨小梁丢失程度，且随TF3的剂量增加，效果越明显。进一步的体外实验结果表明，加入H2O2后，MC3T3-E1的细胞活性明显降低，ROS含量明显增加；而同时加入TF3后，ROS水平明显下降，抗氧化基因Nrf2及其下游的HO-1、CAT表达水平增加，且随TF3浓度增加，效果越明显。结论：TF3可以降低OVX引起的骨丢失程度，其作用可能与TF3具有细胞氧化损伤的保护作用有关。

关键词：
3′-双没食子酸酯
MC3T3-E1细胞
氧化应激
茶黄素-3
骨质疏松
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骨质疏松是一种全身性疾病，颌骨的骨质疏松会影响种植体与骨组织的骨结合[1,2,3,4]。该病的预防仍是目前的难点和热点。骨质疏松时，成骨细胞的成骨能力下降。因此，如何促进其成骨能力一直是研究的热点。目前，骨形成的机制尚不明确。现有研究表明，影响骨形成的因素有很多，包括激素、细胞因子、转录因子、miRNA等[5,6,7,8]。与骨形成关系最密切的是成骨细胞，其增殖分化受多种因素影响[9,10,11]。目前的研究证明氧化应激会导致成骨细胞凋亡增加，骨形成减少[12]。另有报道证明，红茶中的茶黄素-3,3′-双没食子酸酯（TF3）具有较强的抗氧化能力[13]。TF3能否改善骨质疏松及其作用机制未见相关报道。本研究建立小鼠骨质疏松模型和MC3T3-E1细胞氧化应激模型，探讨TF3对骨质疏松小鼠骨丢失的作用，并对其机制进行初步探讨。

1、材料和方法

1.1材料

MC3T3-E1细胞（武汉普诺赛生命科技有限公司，中国）；茶黄素-3,3′-双没食子酸酯（上海伏龙生物科技有限公司，中国）；α-MEM培养基（Hyclone公司，美国）；胎牛血清（BI公司，以色列）；胰蛋白酶（凯基公司，中国）；CCK-8试剂盒（碧云天公司，中国）；DCFH-DA荧光染料（Sigma公司，美国）；TRIzol试剂、逆转录试剂盒（Takara公司，日本）；实时荧光定量PCR(qRT-PCR）试剂盒（翊圣公司，中国）。

1.2药物配制

电子天平称取10mgTF3溶于1150μL无水乙醇中，配制得到浓度为1×104μmol/L的储存液，避光置于-20℃下保存。用α-MEM培养基将储存液分别稀释至1μmol/L和10μmol/L作为工作液，工作液避光保存于4℃下。

1.3动物实验分组及Micro-CT扫描

雌性C57BL/6J小鼠（8周龄）24只，SPF级，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]。所有动物实验在同济大学实验动物中心进行，且获得同济大学动物伦理委员会批准。将小鼠随机分为假手术组（Sham组）、卵巢切除组（OVX组）、低浓度TF3治疗组和高浓度TF3治疗组，每组各6只。Sham组仅切除卵巢周围脂肪组织,其余组切除小鼠双侧卵巢。术后1周，治疗组腹腔注射TF3(1mg/kg和10mg/kg),Sham组和OVX组腹腔注射0.9%氯化钠溶液,每周给药3次。连续给药3个月后，处死小鼠,取双侧股骨并剔净软组织,4%多聚甲醛固定。将各组股骨进行Micro-CT分析。

1.4细胞培养

MC3T3-E1细胞于含10%胎牛血清及1%青霉素、链霉素混合液的α-MEM完全培养基中，培养于37℃、5%CO2的培养箱中。细胞融合至80%～90%时以1∶3的比例传代。

1.5CCK-8实验

细胞以2×103/孔的密度接种于96孔细胞培养板中，24h后加入300μmol/LH2O2和不同浓度的TF3(0、1、10、20、40μmol/L）。4h后去除培养液，每孔加入新鲜配制的含10μLCCK-8和90μLα-MEM培养基的液体，避光孵育2h后，于450nm波长处测量吸光度值。

1.6建立细胞氧化应激模型

用浓度为300μmol/L的H2O2处理MC3T3-E1细胞4h。并将实验分为4组：阴性对照组（NC组）：不做任何处理，用α-MEM完全培养液培养4h；阳性对照组（C组）：加入300μmol/LH2O2处理4h；低浓度药物组（L组）：加入300μmol/LH2O2和1μmol/LTF3处理4h；高浓度药物组（H组）：加入300μmol/LH2O2和10μmol/LTF3处理4h。

1.7细胞内ROS检测

细胞以3×104/孔的密度铺于24孔细胞培养板中，24h后，按上述分组分别加入不同的处理因素作用4h，然后去除培养液，磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗3次。将新鲜配制的浓度为10μmol/L的DCFH-DA溶液加入每孔中，避光孵育30min后，去除染液，用PBS洗3次，在荧光显微镜下拍照。

1.8实时荧光定量PCR检测

细胞以1.5×105/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，按上述分组分别处理细胞4h。用TRIzol法提取细胞总RNA，将1μg总RNA逆转录为cDNA，然后进行实时荧光定量PCR检测。引物序列见表1。小鼠GAPDH基因用作内参。

1.9统计分析

所有数据均使用SPSS20.0进行分析，使用的统计学方法是单因素方差分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1TF3对股骨骨小梁丢失的作用

为了检测TF3对骨质疏松的作用，我们建立了OVX骨质疏松小鼠模型。Micro-CT分析结果表明，TF3可以减少OVX引起的骨小梁丢失，并随剂量增加，效果越明显（图1）。

表1引物序列

图1Micro-CT示TF3对小鼠股骨骨小梁丢失的作用

2.2TF3对MC3T3-E1细胞活性的作用

结合文献[14]，用300μmol/LH2O2处理MC3T3-E1细胞4h可建立氧化应激模型。我们在此基础上检测了不同浓度的TF3(0、1、10、20、40μmol/L）对细胞活性的影响。结果表明，20μmol/L以下的TF3不会影响细胞的活性（图2）。根据实验结果，我们分别选择了1、10μmol/L作为后续实验的药物浓度。

2.3TF3对细胞内ROS的作用

为了检测TF3对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞内ROS的产生情况，我们使用DCFH-DA荧光染料检测细胞内ROS的水平。结果表明，与NC组相比，H2O2显著增加了细胞内ROS的产生，而TF3处理组（L组和H组）细胞内ROS的水平显著降低，且随TF3浓度增高，效果越明显（图3）。

2.4TF3对细胞抗氧化基因表达的作用

为了阐明TF3减少ROS的原因，我们从基因水平方面研究了TF3的作用机制。结果显示，TF3可以提高抗氧化基因Nrf2的表达水平，并增加其下游基因HO-1、CAT的表达，并随着TF3浓度增加，效果越明显（图4）。

图2TF3对细胞活性的影响

图3TF3对细胞内ROS的作用

3、讨论

TF3是红茶中的主要成分，具有抗炎、抗氧化等多种药理活性[15,16]。TF3可以通过抑制ROS的产生减少破骨细胞的形成，抑制骨吸收[17,18,19]。细胞内ROS的含量受到转录因子Nrf2的调控，当细胞内ROS升高时，胞质中的Nrf2进入细胞核，与抗氧化反应元件（ARE）结合[20,21,22]，促进下游抗氧化酶的表达，进而清除过多的ROS。有关TF3对骨质疏松的作用及作用机制，目前尚未见报道。

图4TF3对细胞抗氧化基因表达的作用

OVX骨质疏松模型是一种能很好地模拟因雌激素减少引起骨质疏松的经典模型。雌性动物卵巢被切除后，雌二醇水平降低,模拟了绝经后妇女的高转换型骨质疏松状态。这类模型成功率高、重复性好、适用范围广。因此，我们建立了小鼠OVX模型以检测TF3在小鼠体内对骨质疏松的预防作用。股骨Micro-CT分析结果显示，注射3个月TF3后，OVX引起的骨小梁丢失程度可以降低，治疗组骨小梁的数目和体积明显大于OVX组，且随着TF3剂量的增加，这种预防作用更加明显。

为了进一步探讨TF3预防骨质疏松的原因，我们使用前成骨细胞系MC3T3-E1进行机制部分的探讨。骨质疏松时，细胞内ROS水平增加，细胞处于氧化应激状态，可影响成骨细胞的增殖和功能[14,23,24,25]。因此本实验用H2O2建立了细胞氧化应激模型，研究TF3对细胞氧化应激的作用及机制。CCK-8实验结果与既往研究结果不同，可能与细胞类型不同、处理时间不同有关。DCFH-DA染色结果显示，经H2O2处理后，能够建立较为成功的氧化应激模型，这与以往的研究结果一致[14]。TF3在H2O2诱导的细胞氧化应激过程中确实发挥了抗氧化作用，减少了细胞内ROS的产生，对H2O2诱导的MC3T3-E1细胞的氧化损伤具有保护作用。由于Nrf2在抗氧化过程中发挥了重要作用，我们进一步检测了抗氧化基因的表达。qRT-PCR结果表明，TF3可以促进Nrf2及其下游基因HO-1、CAT的表达，清除细胞内过多的ROS。

综上所述，TF3可能通过增加抗氧化基因Nrf2、HO-1及CAT的表达，清除过多的ROS，发挥抗氧化作用，保护细胞免受氧化应激损伤，从而抑制OVX骨质疏松小鼠股骨的骨小梁丢失，这可为骨质疏松的预防和治疗提供潜在的靶点。关于TF3影响成骨分化的具体机制尚有待于进一步研究。

艾泽馨,李家,吴洋欧,于淼,李生娇.茶黄素-3,3′-双没食子酸酯对骨质疏松的作用及机制初探[J].口腔颌面外科杂志,2020,30(04):206-210.

基金:上海市科学技术委员会项目(19140904800､16ZR1439700)