口腔白斑为口腔最重要的潜在恶性病变，是口腔鳞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）的主要来源之一。白斑由增生到异常增生再到癌变，是一个致癌基因改变逐步积累后，导致细胞异常和不可控生长，直到癌症发生的多步骤过程[1]。2015年全球有354 864例新发口腔癌[2]，口腔鳞癌已成世界范围的健康问题。目前，筛选中药有效成分被认为是一个探求肿瘤化学预防药物的有效途径。

穿心莲内酯（andrographolide,AND）是源于穿心莲（andrographis paniculata）的二萜内酯类化合物，具有抗炎[3]、抗肿瘤[4]等活性。Yang等[5]证实，AND有抗OSCC增殖的活性。Manoharan等[6]证实AND有防治仓鼠颊囊癌变的活性。陈博艺等[7]总结出AND是通过诱导肿瘤细胞凋亡、影响不同细胞周期蛋白的表达、抑制肿瘤细胞周期进展等方面，发挥其抗肿瘤作用。但AND溶解度低、生物利用度差的缺点，限制了其临床应用。纳米载体是提高药物生物利用度的有效方式[8]。Yang等[9]证实，载有AND的固体脂质纳米粒（AND-solid lipid nanoparticles,AND-SLNs）可增加AND溶解度，SLNs是增加AND生物利用度的理想载体。本研究通过对比纳米化的AND(AND-SLNs）与普通AND，对OSCC或白斑细胞株细胞抑制作用的差异，探讨纳米化能否增强AND的抗肿瘤增殖作用，为体内实验提供基础。

1、材料和方法

1.1药物与试剂

1.1.1实验用药物

AND-SLNs与AND由上海中医药大学王长虹教授团队提供，保存于恒温干燥箱中。AND纯度为98%。实验用每批次AND-SLNs浓度由王长虹教授团队制备后用HPLC法测量获得；现用现配，80℃水浴后用0.22μm滤器过滤。

1.1.2实验用细胞系及培养条件

OSCC细胞系HN6由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔肿瘤实验室（上海市口腔重点实验室）提供，口腔白斑细胞系Leuk1由美国马里兰州马里兰大学牙科学院毛力教授提供。将HN6细胞置于DMEM高糖培养液（上海源培生物科技股份有限公司，C40306）中培养。将Leuk1细胞置于人角化上皮细胞培养液[（keratinocyte serum free medium,K-SFM）+表皮生长因子]中培养。所有细胞均在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内培养。参照美国模式培养物集存库（American type culture collection,ATCC）提供的标准培养条件在10 cm培养皿中养殖细胞。待细胞在预成培养液中生长至70%～80%时接种。

1.2细胞实验

1.2.1细胞摄取药物定量实验研究[10]

HN6、Leuk1细胞系以1×105个/mL的细胞密度分别接种在2块24孔板中孵育，每孔1 mL。孵育24 h细胞贴壁后，24孔板培养液中加入适量的AND-SLNs和AND药物储存液，使培养液中2种药物均有8、80μg/mL共2种质量浓度，在37°C培养箱内孵育2 h，各有3个复孔。去除培养液，24孔板内加入300μL/孔的4%的多聚甲醛溶液固定10 min；磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline,PBS）洗涤1次，时长5 min。按200μL/孔加入细胞裂解液EBC（不加蛋白酶抑制剂），轻微振荡15 min。细胞裂解液中的AND药物质量浓度用高效液相色谱仪（HPLC）检测。

1.2.2细胞增殖抑制试验（MTS法）[11]

HN6和Leuk1细胞以30个/μL的细胞密度接种于96孔板内。在96孔板最外一圈的孔内只加入PBS，排除边缘效应。96孔板置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内过夜。次日，吸除一侧纵行6孔内培养液，立即加入用培养液配制好的药液，AND-SLNs和AND在96孔板中从200μg/mL的原始质量浓度依次稀释9次，即200、100、50、25、2.5、0.25、0.025、0.002 5、0.000 25和0.000 025μg/mL共10个质量浓度梯度，每个质量浓度的药物各有6个复孔，放入培养箱内，分别培养24、48、72、96 h。在1 mL的CellTiter 96誖AQueous One Solution Reagent内加入5 mL的PBS(1∶5稀释）混合备用。在各个时间点，吸去相应孔内培养液。立即在每孔内加入120μL准备好的CellTiter 96誖Aqueous One Solution Reagent/PBS混合液。将96孔板置于培养箱内，作用4 h后取出。用SunriseTM光吸收酶标仪检测每孔在490 nm的吸光度值（optical density,OD值）。存活率=实验组OD值/空白对照组OD值×100%。实验重复3次。

1.2.3流式细胞仪检测细胞增殖周期阻滞实验[12]

以细胞增殖抑制实验获得2种药物在48 h时HN6、Leuk1细胞的IC50值为实验组药物质量浓度，配取相应培养液及没有药物的培养液作为阴性空白对照。HN6和Leuk1以3×104个/mL的细胞密度各10 mL接种于6个10 cm的培养皿中，饥饿过夜、待细胞贴壁。37℃培养箱孵育12 h,0.25%胰酶消化，每组收集大约6×105个细胞，室温下以1 000 r/min的速率离心3 min，用3 mL预冷的PBS洗涤1次，在4℃下用3 mL预冷的70%乙醇溶液固定4 h或过夜。细胞再以1 000 r/min速率离心3 min，用预冷的PBS洗涤1次，用402.75μL冷的PBS重悬细胞，加入2.25μL的核糖核酸酶A(RNase A)(10 mg/m L）和45μL的碘化丙啶（propidium iodide,PI)(1 mg/mL),4℃避光孵育30 min。流式细胞仪分析。实验重复3次。

1.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡实验[13]

HN6和Leuk1以3×104个/mL的细胞密度接种，2.5 mL/孔，各3块6孔板，过夜待细胞贴壁。次日，吸除1块6孔板中的培养液，加入含有48 h IC50质量浓度的药物培养液，培养箱内孵育12 h；再去除1块6孔板中的培养液，加入含有48 h的IC50质量浓度的药物培养液，培养箱内孵育6 h；第3块6孔板作为阴性空白对照。孵育结束后，按Alexa Fluor誖488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit试剂盒要求收集细胞，用冷的PBS洗涤1次。转移细胞悬液至流式管内，1 000 r/min速率离心3 min，重新离心细胞，弃上清液，并用1×膜联蛋白结合缓冲液100μL重悬细胞。在含有约2.25×105个细胞的悬液100μL中加入5μL的Annexin V-FITC(Annexin V-fluorescein isothiocyante）和5μL的50μg/mL PI工作液；在室温、避光条件下，共同孵育15 min。在冰上，将400μL的1×膜联蛋白结合缓冲液加入100μL的细胞悬液中并轻柔混合后，用流式细胞仪和随机软件分析细胞凋亡结果。实验重复3次。

1.3统计方法

用SPSS 19.0软件统计处理实验数据，用独立样本t检验分析。用GraphPad Prism 6.0作统计图。P<0.05判断为差异有统计学意义。

2、结果

2.1细胞定量摄取实验

HN6细胞经AND-SLNs处理后以8、80μg/mL的质量浓度分别孵育2 h后，吸收AND的量为24.20、82.84μg/mL，对应AND组的吸收量为0.00、9.17μg/mL。AND-SLNs组细胞吸收量均比AND组多，且随药物质量浓度的增加细胞吸收量也增加（图1A）。

Leuk1细胞经AND-SLNs处理后以8、80μg/mL的质量浓度分别孵育2 h后，吸收AND的量为6.28、13.46μg/mL，对应AND组的吸收量为6.06、16.81μg/mL。同质量浓度AND-SLNs和AND的药物吸收量相差不明显，但均随药物质量浓度的增加而增加（图1B）。

图1 HPLC定量检测细胞摄取药物实验

2.2细胞生长增殖抑制试验（MTS法）

如图2A和2B所示，药物作用于HN6细胞48 h后，AND-SLNs和AND的IC50分别为6.09、13.75μg/mL。药物作用于Leuk1细胞48 h后，AND-SLNs和AND的IC50分别为0.72、26.14μg/mL。

图2用MTS方法进行细胞增殖抑制实验

2.3流式细胞仪分析细胞周期阻滞实验

6.09μg/mL的AND-SLNs和13.75μg/mL的AND作用于HN6细胞12 h，在细胞G0/G1期为（55.41±2.00）%对（30.75±9.33)%,P=0.01；在细胞增殖期（G2/M+S）为（44.59±2.00）%对（69.25±9.33)%,P=0.039。详见图3A、3B。

0.72μg/mL的AND-SLNs和26.14μg/mL的AND作用于Leuk1细胞12 h，在细胞G0/G1期为（61.65±7.62）%对（41.49±4.34)%,P=0.016；在细胞增殖期（G2/M+S）为（38.35±7.62）%对（58.51±4.34)%,P=0.026。详见图3C、3D。

2.4流式细胞仪分析细胞凋亡实验

6.09μg/mL的AND-SLNs和13.75μg/mL的AND作用于HN6细胞6 h或12 h后的情况如下。6 h的早期凋亡率为（5.45±0.36）%对（3.74±0.04)%,P=0.022；晚期凋亡率为（2.62±0.32）%对（1.59±0.23)%,P>0.05；总凋亡率为（8.06±0.68）%对（5.33%±0.27)%,P=0.034（图4A、4B）。12 h早期凋亡率为（3.24±0.23）%对（3.38±0.39)%,P>0.05；晚期凋亡率为（7.04±0.38）%对（1.46±0.08)%,P=0.002；总凋亡率为（10.28±0.16）%对（4.84±0.30)%,P=0.002（图4C、4D）。部分差异有统计学意义，与药物抑制增殖曲线相符。

图3流式细胞仪检测细胞周期阻滞实验

0.72μg/mL的AND-SLNs和26.14μg/mL的AND作用于Leuk1细胞6 h或12 h后的凋亡率如下。6 h早期凋亡率为（0.47±0.17）%对（0.36±0.02)%,P>0.05；晚期凋亡率为（11.30±0.04）%对（11.53±0.04)%,P>0.05；总凋亡率为（11.77±0.13）%对（11.88±0.01)%,P>0.05（图4E、4F）。12 h早期凋亡率为（0.30±0.01）%对（0.43±0.13)%,P>0.05；晚期凋亡率为（23.73±0.11）%对（14.27±0.69)%,P=0.003；总的凋亡率为（23.99±0.11）%对（14.70±0.81)%,P=0.004（图4G、4H）。部分差异有统计学差异，与药物抑制增殖曲线相符。

3、讨论

3.1关于穿心莲有效成分通过纳米技术提高生物利用度的思考

纳米化学预防最早由Mukhtar团队提出[14]。姜黄[15]、染料木黄酮[16]等化学预防药物研究显示，纳米粒子载药系统能使天然植物药物减毒。

AND纳米化研究证明，纳米剂型改变的AND可优化细胞表面转运方式、提高生物利用度、增强AND生物活性，可作为治疗疾病的新剂型[17,18]。为研究植物天然产物AND应用于预防和治疗OSCC的可能，本课题组与上海中医药大学中药研究所王长虹教授的团队合作，其中关于AND-SLNs及AND的制备和特性已发表[9,19]。通过体外细胞实验，探索具有抗癌活性的AND纳米化后，被细胞摄取的情况和抑制OSCC和白斑细胞增殖的效果。

图4 Annexin V-PI凋亡实验

3.2 AND及其固体脂质纳米粒抗OSCC细胞和白斑细胞的有效性和差异性

细胞定量摄取药物实验结果显示，AND-SLNs更能促进HN6细胞对AND的吸收，且具有浓度-时间依赖性和一定的细胞特异性。本实验说明AND-SLNs更能促进细胞对AND的吸收，固体脂质纳米粒作为载体促使AND进入细胞内达到较高程度的聚集，从而提高AND的生物利用度。

细胞增殖抑制实验结果证明，AND纳米化后仍具有抑制OSCC增殖的活性，同时两者也均有抑制白斑细胞增殖的活性。这与Wang等[20]的研究结果相符。实验结果显示AND-SLNs对2个细胞系在48 h的IC50均小于AND，且具有时间-浓度依赖性和一定的细胞特异性，证明AND-SLNs抑制OSCC和白斑细胞增殖的生物活性比单纯AND更强。

细胞周期阻滞实验结果证明，AND-SLNs比单纯的AND更明显阻滞HN6和Leuk1细胞增殖周期于G0/G1期，其阻滞细胞增殖周期的活性更强，进而能更强地抑制细胞进入生长增殖期。

细胞凋亡实验证明，AND-SLNs在作用HN6和Leuk1细胞6 h和12 h后，与AND的作用相比均有统计学差异，说明AND-SLNs具有更强的诱导细胞凋亡的生物活性，从而证明AND-SLNs抗OSCC和白斑细胞的活性更强。

3.3 AND及其固体脂质纳米粒抗OSCC细胞和白斑细胞可能的机制

Roy[17]、Yang[9]、Yen[18]及杨涛等[19]对AND纳米化的研究结果均表明，以相应的纳米粒作为载体能够增强细胞对AND的摄取，提高AND的生物利用度，增强AND的生物活性，加强对寄生虫的杀灭，显著恢复小鼠受损的肝功能，更好地稳定血压、更强地抑制癌细胞增殖和抑制胃肠道炎症反应。

本研究提示可能由于纳米载体促进了细胞对药物摄取，提高药物在靶细胞中的浓度，从而明显抑制细胞生长增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡，表现出更强的抗OSCC细胞和白斑细胞活性。但其具体作用机制和信号通路还待进一步研究。

3.4体外细胞实验结果与体内实验研究展望

Wang[20]、Manoharan[6]、Hsieh[21]及Yang等[5]均通过体内实验证明了AND具有防治口腔黏膜癌变的活性。本次实验显示，纳米化的AND抗OSCC细胞和白斑细胞的增殖活性强于单纯的AND，因而可考虑进一步应用合适的动物模型，通过体内实验来阐明纳米化的AND在白斑恶性转变过程的作用。此外，相关AND的靶向配体可靶向连接纳米粒到癌细胞表面过度表达的特异性受体。因此，研究AND的靶向配体可为临床上使用AND化学预防白斑癌变提供实验依据。

综上所述，本文的体外细胞实验初步证明，纳米化的AND对OSCC细胞和白斑细胞具有更显著的抗增殖活性的潜能。本次实验表明AND-SLNs纳米剂型有望成为抗癌化学预防药物的第1步，为下一步的体内研究提供了实验基础。

参考文献：

[3]覃林花,郑智武,孔玲,等.穿心莲内酯对肿瘤坏死因子-α和白介素-12表达的抑制作用[J].第二军医大学学报, 2011, 32(7):717-720.

[7]陈博艺,屈丽丽,刘建生.穿心莲内酯抗肿瘤的作用及其机制研究进展[J].中国临床新医学, 2017, 10(7):695-698.

[19]杨涛,盛欢欢,程雪梅,等.星点设计-效应面法优化穿心莲内酯固体脂质纳米粒处方[J].中国医药工业杂志,2012, 43(9):752-755.

李宏权,姜继宗,马亭云,吴玉波,钱文昊,王长虹.穿心莲内酯纳米粒对口腔鳞癌HN6细胞株和白斑Leuk1细胞株抑制作用的实验研究[J].口腔颌面外科杂志,2020,30(04):216-221.

基金:上海市徐汇区医学高峰学科(SHXH201706);上海市徐汇区医学科研项目(面上项目)(SHXH201718);上海市医学重点专科项目(ZK2019B12)