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外周血乳酸及细胞毒性T淋巴细胞在口腔鳞状细胞癌中的临床应用

2021-06-15 121 上传者：管理员

摘要：目的探讨外周血乳酸（LA）和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）水平在口腔鳞状细胞癌（简称鳞癌）发生、发展中的意义。方法选取2018年11月至2020年9月在北京口腔医院住院的口腔鳞癌患者50例（Ⅰ～Ⅱ期25例,Ⅲ～Ⅳ期25例）作为试验组,同期健康陪护家属70例作为对照组。检测所有研究对象外周血LA、淋巴细胞计数及CTL水平,并分析上述指标在试验组与对照组及不同TNM分期口腔鳞癌患者中的水平变化。结果试验组外周血LA水平高于对照组,CTL水平低于对照组,差异均有统计学意义（P<0.05）;Ⅲ～Ⅳ期口腔鳞癌患者外周血LA水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者,CTL水平低于Ⅰ～Ⅱ期患者,差异均有统计学意义（P<0.05）;LA水平与CTL呈负相关（r=-0.551,P<0.05）。结论口腔鳞癌患者外周血LA水平与CTL呈负相关,二者与口腔鳞癌的发生、发展相关,可作为潜在的口腔鳞癌病情评估的筛查指标。

关键词：
乳酸
口腔鳞癌
筛查指标
细胞毒性T淋巴细胞
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早在1930年，奥托·沃伯格就证明了癌细胞即使在氧气存在的情况下也依赖糖酵解作用，这种现象被称为有氧糖酵解，即“Warburg效应”[1]。与正常细胞相比，肿瘤细胞具有代谢表型改变的特点。肿瘤细胞可以利用糖酵解产生能量，并产生大量乳酸（LA）。有研究表明，LA对人细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的增殖和细胞因子产生的抑制率高达95%，细胞毒活性可降低50%[2]，使机体细胞免疫功能下降，从而为癌细胞的生长扩散提供有利条件。口腔鳞状细胞癌（简称鳞癌）是指发生于口腔内，以鳞状细胞为主的恶性肿瘤。癌细胞可以发生于牙龈、硬腭、舌体、颊黏膜、嘴唇等等多种器官，属于头颈部恶性程度最高、危害性最大的肿瘤[3]。目前，肿瘤微环境代谢变化引起的CTL的变化在口腔鳞癌中的作用研究相对较少。本文通过测定分析健康者与不同临床分期的口腔鳞癌患者外周血LA及CD8+T细胞水平，从口腔鳞癌患者代谢水平与机体免疫功能的关系方面，探讨LA及CTL在口腔鳞癌发生、发展中的意义。

1、资料与方法

1.1一般资料

选择2018年11月至2020年9月在本院口腔颌面-头颈肿瘤科住院治疗的口腔鳞癌患者50例为试验组。纳入标准：年龄20～70岁，经病理组织学诊断为鳞癌且未进行放化疗处置者。排除标准：（1）既往有其他肿瘤史者；（2）伴有其他系统性疾病者；（3）不愿意参与此项研究者。试验组年龄20～70岁；男26例，女24例；舌癌18例，牙龈癌11例，口底癌11例，颊癌5例，唇癌5例；TNM分期[美国癌症联合会（AJCC）第八版]Ⅰ～Ⅱ期25例，Ⅲ～Ⅳ期25例。另选择同期在本院口腔颌面-头颈肿瘤科住院患者的陪护家属且身体健康者70例为对照组，年龄20～70岁，其中男36例，女34例。2组年龄、性别构成差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究方案获得首都医科大学附属北京口腔医院伦理委员会批准（审查批件号：CMUSH-IRB-KJ-PJ-2018-14），所有研究对象均签署了知情同意书。

1.2仪器与试剂

白洋离心机购自北京白洋医疗器械有限公司，SysmexXS-500i血细胞分析仪购自日本Sysmex公司，SiemensRXL-MAX生化分析仪购自德国Siemens公司，FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司。血常规检测试剂为血细胞分析仪配套试剂，LA测定试剂为生化分析仪配套试剂。Fc受体封闭剂、PerCP-Cy5.5标记的CD3单克隆抗体（CD3-PerCP-Cy5.5）、异硫氰基荧光素（FITC）标记的CD8单克隆抗体（CD8-FITC）均购自达科为生物技术股份有限公司，一次性含氟化钠真空采血管和一次性ED-TA抗凝真空采血管购自美国BD公司。

1.3方法

1.3.1标本采集与处理

采用一次性含氟化钠真空采血管和一次性EDTA抗凝真空采血管，每管内采集所有研究对象空腹外周静脉血2mL。一次性含氟化钠真空采血管内外周血以2500r/min离心10min，取上层血浆立即进行LA含量测定。一次性EDTA抗凝真空采血管内外周血颠倒混匀8次后即进行血常规检测，完成血常规检测后的标本用于流式细胞分析。

1.3.2标本检测

用全血细胞分析仪进行血常规检测，得出淋巴细胞计数。对分离的血浆立即用全自动生化分析仪及LA测定试剂盒检测LA水平。从ED-TA抗凝管中取100μL新鲜静脉血，加入Fc受体封闭剂5μL，室温孵育10min后，分别加入CD3-PerCP-Cy5.5、CD8-FITC各3μL，在室温下避光孵育20min，然后加入红细胞裂解液2mL，室温避光裂解红细胞15min,350×g离心5min，弃去上清液，加入磷酸盐缓冲液（PBS)2mL离心洗去血红蛋白，并重新悬浮于300μLPBS中，用流式细胞仪检测2组CD3+和CD8+双阳性T细胞的百分比。根据淋巴细胞计数及CD3+和CD8+双阳性T细胞的百分比计算出2组研究对象外周血CTL的绝对值。

1.4统计学处理

采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，样本方差齐性检验采用F检验，方差齐的2组间样本均数比较采用t检验；计数资料以频数表示；采用Pearson相关分析LA水平与CTL的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1试验组与对照组外周血LA、淋巴细胞计数及CTL水平比较

对2组外周血LA、淋巴细胞计数及CTL水平进行方差齐性检验，2组的LA、淋巴细胞计数及CTL水平方差齐。采用t检验对2组外周血LA、淋巴细胞计数及CTL水平进行比较，结果显示，试验组LA水平高于对照组，淋巴细胞计数和CTL水平低于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1试验组与对照组LA、淋巴细胞计数及CTL水平比较

2.2不同TNM分期口腔鳞癌患者外周血LA、淋巴细胞计数及CTL水平比较

对Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期口腔鳞癌患者外周血LA、淋巴细胞计数及CTL水平进行方差齐性检验，2组不同TNM分期口腔鳞癌患者的LA、淋巴细胞计数及CTL水平方差齐。采用t检验对2组不同TNM分期口腔鳞癌患者外周血LA、淋巴细胞计数及CTL水平进行比较，结果显示，Ⅲ～Ⅳ期口腔鳞癌患者的LA水平高于Ⅰ～Ⅱ期，CTL水平低于Ⅰ～Ⅱ期，差异均有统计学意义（P<0.05），而淋巴细胞计数差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2不同TNM分期口腔鳞癌患者LA、淋巴细胞计数及CTL水平比较

2.3口腔鳞癌患者LA水平与CTL水平的相关性分析

Pearson相关分析显示，随着口腔鳞癌患者LA水平升高，CTL水平相应降低，其LA水平与CTL呈负相关（r=-0.551,P<0.05），见图1。

图1口腔鳞癌患者LA水平与CTL间关系散点图

3、讨论

口腔鳞癌患者LA水平与健康者比较明显升高，说明肿瘤细胞糖酵解作用增强，使pH值下降。肿瘤微环境的缺氧状态可以上调编码葡萄糖转运蛋白和LA脱氢酶基因，从而增加了LA的分泌，且糖酵解作用也产生大量LA。GATENBY等[4]提出肿瘤细胞的这种“糖酵解代谢”具有生长优势，是人类侵袭性癌症进化的必要条件。WALENTA等[5,6,7]发现肿瘤组织中LA水平与肿瘤转移的发生率以及癌症患者总体生存率的降低之间存在相关性。FISCHER等[2]的研究中也提示了140例患有不同实体肿瘤的患者血清LA水平与肿瘤负荷之间可能相关。本研究显示，在不同临床分期的口腔鳞癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期口腔鳞癌患者LA水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者（P<0.05），表明LA水平与口腔鳞癌的发展可能相关，这一指标对预测肿瘤的发生和发展有一定的指导意义。

口腔鳞癌患者外周血淋巴细胞计数水平明显低于健康者（P<0.05），与机体抗肿瘤免疫有关，说明细胞免疫在口腔鳞癌中发挥着重要作用。但在不同分期的口腔鳞癌患者中，Ⅲ～Ⅳ期口腔鳞癌患者同Ⅰ～Ⅱ期口腔鳞癌患者比较，外周血淋巴细胞计数水平差异无统计学意义（P>0.05）。可能是由于随着肿瘤的进展，主要是CTL的作用逐渐减弱[8]，淋巴细胞亚群比例发生变化，而淋巴细胞计数作为口腔鳞癌进展程度的筛查指标灵敏度较差。

根据SAVINA等[9]的研究结果，针对肿瘤抗原的有效免疫反应需要活化和募集CD8+T细胞，从而发挥细胞毒效应。本研究中口腔鳞癌患者相对健康者而言，发挥细胞毒作用的CD8+T细胞水平明显降低，且口腔鳞癌晚期患者相对于早期患者而言，CTL下降更为明显（P<0.05），也反映了肿瘤发生、发展过程中机体免疫监视状况的变化，越是进展到口腔鳞癌的晚期，CTL水平的下降越明显，从而更有利于癌细胞的浸润生长。FISCHER等[2]的研究中显示，浸润性CTL在进入肿瘤部位后不久就失去了重要的功能，其关键特征是细胞溶解能力受阻。口腔鳞癌可来源于一些恶性病变，如黏膜白斑。如果病变提示口腔上皮发育不良，则恶性转化的可能性增加[10]。机体免疫系统在识别肿瘤前体细胞中发挥重要作用。根据免疫监视和免疫编辑假说，肿瘤细胞可以逃避免疫系统的监视。这个假说认为宿主和恶性细胞之间的相互作用是由3个阶段驱动的，即消除期、平衡期、逃逸期。一些肿瘤细胞在消除阶段被识别并清除，一些恶性转化细胞能够存活至平衡期。在逃逸期，持续生存的细胞增殖为肿瘤[11]。口腔鳞癌患者中也存在着明显的细胞免疫功能降低。

LA水平与CTL的相关性分析显示，随着口腔鳞癌患者LA水平升高，CTL水平相应降低，说明肿瘤细胞特有的代谢特征会对机体免疫系统产生影响，并在口腔鳞癌的进展中发挥作用。LA可以抑制人CTL的增殖，从而利于肿瘤细胞的转移生长。LA酸中毒常见于大多数实体瘤患者，且影响免疫细胞的浸润[12]。单羧酸转运蛋白-1(MCT-1）是细胞转运LA的蛋白，在心脏、肝脏、小肠、骨髓、骨骼肌、脾脏、大脑等组织中高表达[13]，其对LA的转运依赖于细胞质与胞外LA的水平梯度。有报道指出淋巴细胞也有MCT-1、MCT-2、MCT-4的表达[14]。肿瘤微环境中高水平的LA阻碍了MCT-1向T细胞外转运LA，从而干扰了T细胞的代谢和功能，影响机体的免疫功能。活化的T细胞利用糖酵解作用依赖于LA的有效分泌[15]。如果LA积累在细胞内，则会干扰其新陈代谢，最终抑制CTL的增殖和活化。口腔鳞癌患者在LA升高的同时伴随着CTL的下降，可能与肿瘤微环境中高水平LA的积累有关。

综上所述，口腔鳞癌患者外周血LA水平的增高伴随着CTL水平的下降，说明癌细胞的糖酵解代谢可能会对机体免疫系统产生影响，提示了口腔鳞癌患者肿瘤微环境中高水平的LA积累使CTL中的LA分泌受阻，干扰了T细胞代谢，抑制其细胞毒性效应的发挥。外周血LA和CTL水平与口腔鳞癌的发生、发展有关，可以作为潜在的口腔鳞癌病情评估的筛查指标。

参考文献：

[8]彭功玲,王龙强,李强,等.LuminaB型乳腺癌与肿瘤浸润叉状头/翅胯状螺旋转录因子+调节性T淋巴细胞和CD8+细胞毒性T淋巴细胞预后的关系[J].中华实验外科杂志,2019,36(11):1975-1977.

[10]程俊盘,白贺天,常治楠,等.口腔黏膜癌前病变和口腔癌动物模型的研究进展[J].华西口腔医学杂志,2020,38(2):198-204.

[12]齐瑞丽,张勇丹,王华庆,等,免疫检查点抑制剂联合抗血管生成治疗恶性肿瘤的作用机制[J.临床肿瘤学杂志,2020,25(7):664-668.

[13]董贤文,付琳,张丽,等.消化道上皮单羧酸转运蛋白1(MCT1)跨膜转运功能的调控机理[J]﹒核农学报,2021,35(2):349-356.

[15]罗雨虹.T细胞的效应功能受有氧糖酵解的转录后调控[J].生理科学进展,2013,44(3):199.

文章来源：赵红,冯芝恩,李德龙,段立莉,栗景蕊.外周血乳酸及细胞毒性T淋巴细胞在口腔鳞状细胞癌中的临床应用研究[J].国际检验医学杂志,2021,42(11):1342-1345.

基金：北京市医院管理局临床医学发展专项“扬帆”计划项目(XMLX201819);北京口腔医院学科建设基金项目(18-09-20)