骨髓增生异常综合征(MDS)是一种起源于多能造血干细胞的异质性恶性髓系克隆性疾病。其临床特征主要表现为由骨髓造血细胞异常发育、无效造血引起的一系或多系的外周血细胞减少，并且约30%的MDS患者具有极高风险向sAML转化的倾向[1,2]。MDS全球发病率为(1-10)/10万，其中中国发病率为(0.23-1.51)/10万，中位发病年龄为62岁，随着年龄的增加发病率逐渐上升。男性发病多于女性，约为1.8∶1;确诊后中位生存期仅15-30个月，3年生存率为42%,5年生存率为29%。MDS的诊断和疾病分层是基于临床表现、外周血细胞数和骨髓细胞形态学及骨髓活检、荧光免疫原位杂交、细胞遗传学、流式细胞术等多项数据[3]。本研究收集131例MDS患者标本，应用二代测序(next-generation sequencing, NGS)技术检测MDS患者基因突变类型、数量和分布情况，并结合MDS患者临床资料分析其之间相关性及影响预后生存的因素，使临床医生更好地了解MDS进化历程并指导临床。

一、材料和方法

病例

收集2015年6月至2023年2月兰州大学第一医院血液科收治的131例初诊MDS患者的临床特征及实验室检查结果，随访期间其中19例进展为sAML(定义为外周血或骨髓原始细胞比例≥20%)。所有患者均经过骨髓形态学、骨髓活检、免疫分型、细胞遗传学及分子生物学等检查确诊。符合MDS相关诊断标准和世界卫生组织(World Health Organization, WHO)关于骨髓增生异常综合征的分型标准(2016版),并根据修订版国际预后评分系统(Revised International Prognosis Scoring System, IPSS-R)进行预后评分。本研究经兰州大学第一医院伦理委员会批准，所有入组患者均签署知情同意书。

基因突变检测

取患者髂前、髂后上棘骨髓约1-1.5 ml分离单个核细胞，常规提取DNA并制备DNA全基因组文库。使用PCR引物扩增目的基因组，将目标区域DNA富集后，采用高通量靶向扩增子测序(Sanger平台),检测基因组DNA点突变(SNV)、插入/缺失(In/Del),涉及血液系统肿瘤相关的25个基因突变，包括SF3B1、SRSF2、U2AF1、ZRSR2、TET2、DNMT3A、IDH1、IDH2、ASXL1、EZH2、RUNX1、BCOR、NPM1、ETV6、TP53、WT1、JAK2、NRAS、KRAS、FLT3、CBL、SETBP1、MPL、STAG2和GANS。

染色体核型分析

短期培养法常规制备染色体标本，采用R显带法进行核型分析，并根据《人体细胞遗传学国际命名体制(ISCN2016)》的规定进行核型描述。

随访

采用医院病历工作系统、门诊、电话等方式进行随访。随访截止时间为2023年4月30日，中位随访时间17.3(0.5-86.5)月。总生存期(overall survival, OS)定义为疾病诊断至死亡或最后一次随访的时间。

统计学分析

采用SPSS 27.0软件包处理数据。基因共突变相关性研究使用Spearman检验。计量资料组间比较采用Kruskal-Wallis方差分析，计数资料组间比较采用卡方检验分析。结果以中位数(范围)或数量(n,%)表示。采用log-rank检验进行单因素分析，Cox回归风险模型进行多因素分析，生存分析采用Kaplan-Meier法。所有结果均设定为双尾，P<0.05示差异有统计学意义。应用R语言绘制基因瀑布图和基因共突变相关图谱，应用Prism 9绘制森林图和生存曲线。

二、结果

患者基线特征

本研究共纳入131例MDS患者，其中男性73例，女性58例，男女比例约为1.3∶1。中位年龄为58(17-86)岁。按照2016年WHO标准分型，MDS伴环状铁粒幼细胞(RA/RARS)15例、难治性血细胞减少伴多系发育异常(MDS-RCMD)57例、MDS伴原始细胞增多(MDS-EB)46例、MDS不能分型(MDS-U)8例、MDS 伴孤立 5q-(MDS-5q-)5例。患者外周血血细胞特征：中位白细胞计数(WBC)为2.49(0.31-43.54)×109/L,中位血红蛋白(Hb)为 69 (23-143) g/L,中位血小板计数(PLT)为44(3-597)×109/L(表1)。

基因突变频率

纳入的131例患者中共检测出148个基因突变、25种突变类型，60%(78/131)的患者可检测到基因突变，其中112例MDS患者的突变率为56.2%(63/112),19例进展为sAML患者的突变率为78.9%(15/19)。基因突变出现频率最高为ASXL1(17.6%, 26/148),其次为TET2(10.1%, 15/148)、RUNX1(8.8%, 13/148)、TP53(8.8%, 13/148)、SF3B1(6.8%, 10/148)(图1)。平均突变数目为1.1(148/131)个，其中24.4%(32/131)携带单个基因突变、19.1%(25/131)携带两个基因突变、16%(21/131)携带3个及以上基因突变。不同功能基因组的发生率分别为：表观遗传调节因子41.9%(62/148)、剪切体因子基因19.6%(29/148)、转录调节因子基因14.9%(22/148)、肿瘤抑制基因因子10.8%(16/148)、信号转导蛋白因子6.8%(10/148)和其他6.1%(9/148)[4]。

基因共突变相关性分析

本研究的6个不同功能基因组中共有18种共突变相关性分析(图2)。U2AF1与其它基因共同突变发生率高达100%,但U2AF1仅与MPL(r=0.875)、SETBP1(r=0.932)、CBL(r=0.939)、DNMT3A(r=0.940)、ASXL1(r=0.733)和ETV6(r=0.875)呈正相关，差异有统计学意义(P<0.05)。ASXL1是整个基因组中突变频率最高的基因，并且与U2AF1(r=0.733)、EZH2(r=0.927)和ETV6(r=0.952)相互伴随出现(P<0.05)。TP53既与BCOR常伴随出现，并且呈现出正相关(r=0.702),也与ASXL1相互排斥(r=-0.316),差异有统计学意义(P<0.05)。

基因突变与细胞遗传学异常的相关性分析

纳入的131例患者中正常核型(NK)患者占61.8%(81/131),异常核型约占38.2%(50/131)。染色体核型有NK、+8、20q-、5q-和复杂核型(complex karyotype, CK)等。81例NK患者中49例至少携带一个基因突变，检出率较高的基因突变有ASXL1(24.9%)和TET2(12.4%)。其中ASXL1(76.9%)突变在NK中的发生率高于异常核型，差异有统计学意义(P=0.026)。50例异常核型的患者中29例患者至少携带一个基因突变，其中U2AF1突变的患者中检测出20q-发生率高于其他异常核型(P=0.02),信号转导通路突变的患者中检测出+8发生率高于其他异常核型(P=0.003),TP53突变型患者中CK的发生率也明显高于其他组(P<0.0001)。

基因突变与临床特征的相关性分析

将78例检出基因突变的患者按照年龄分为<60岁组和≥60岁组，发现两组间NPM1、WT1、SETBP1、SRSF2基因突变发生率存在差异(P<0.05)。表明这些基因突变与患者年龄相关，其中SETBP1和SRSF2基因突变多见于60岁以上患者，而NPM1和WT1基因突变常见于60岁以下患者，并且年龄≥60岁组患者的基因突变数目多于年龄<60岁组的患者(P=0.013)。不同性别的患者SF3B1、RUNX1、DNMT3A基因突变率也存在差异，其中男性SF3B1和RUNX1基因突变发生率高于女性，女性DNMT3A基因突变发生率高于男性(均P<0.05)。SF3B1基因突变与患者检出环性铁粒幼细胞(RS)相关，突变型患者严重贫血(Hb<60 g/L)发生率更高；TET2突变患者具有更高的WBC和较低的骨髓原始细胞水平；ASXL1、TP53和SRSF2基因突变患者外周PLT减少较野生型患者更明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。

MDS是否继发白血病的基因突变差异性比较

进展为sAML与MDS患者在基因突变表达方面存在显著差异。sAML组患者的基因突变数目高于MDS组[1.0(113/112) vs 1.8(35/19);P=0.006]。与MDS组相比，sAML组中信号转导蛋白因子和转录调节因子基因发生率高，NRAS、IDH1、IDH2、NPM1基因突变发生率也高，差异均有统计学意义(P<0.05);而sAML组表观遗传调节因子和剪切体因子发生率高于MDS组，但差异无统计学意义(表2)。

预后分析

将年龄、性别、WBC、Hb、PLT、骨髓原始细胞比例、IPSS-R预后评分、染色体核型、基因突变数目和类型(ASXL1、TET2、TP53、SF3B1、DNMT3A、RUNX1、U2AF1和TP53) 进行预后分析，以确定影响OS的独立预测因子(图3)。单因素分析结果显示，年龄≥60岁、TET2、TP53、骨髓原始细胞比例≥5%、IPSS-R预后评分≥3.5分和基因突变数目≥3个是患者预后不良的因素(P<0.05),而SRSF2和DNMT3A等其他因素未显示出对预后的影响(P>0.05)。进一步多因素分析表明IPSS-R预后评分≥3.5分、TP53突变是预后不良因素。

131例患者中位OS为18.6(0.5-86.5)月，其中51例死亡(图4A)。单等位基因突变(monoallelic mutations, ma-TP53)和野生型(wild type, wt-TP53)TP53患者较双等位基因突变型(biallelic mutations, bi-TP53)患者的OS长(P=0.033)(图4B、C)。与sAML患者相比，MDS患者(未转白)OS更长(中位OS:16.9 vs 11个月，P=0.01)(图4D)。其中3例接受造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)患者均未进展为sAML,并且均处于生存状态，移植患者的OS明显优于未移植的患者(中位OS:81.6 vs 18.2个月，P=0.036)(图4E)。此外，19名患者进展为sAML后分别使用去甲基化药物(hypomethylating agents, HMA)联合HAG(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷、重组人粒细胞集落刺激因子)(n=5)、BCL-2抑制剂维奈克拉(venetoclax)联合阿扎胞苷(azacitidine, AZA)(n=7)和其他治疗(补充造血原料，n=2; AZA,n=2;伊达比星联合阿糖胞苷，n=3),接受HMA联合HAG方案和venetoclax联合AZA方案的患者OS均优于其他治疗(P=0.015)(图4F)。

三、讨论

MDS的发病机制十分复杂，其中包括机体免疫攻击、衰老、放化疗等因素导致微环境变化、免疫失调、体细胞突变等，进而导致祖细胞凋亡增加、分化缺陷，继而出现克隆性增殖而致病。因此，MDS的发病与遗传学、免疫系统及骨髓造血微环境等密切相关，是多因素、多步骤、多基因调控的疾病发病过程。研究发现，MDS相关基因突变的发生并不表现为随机组合，而是随着疾病的不断演变，驱动基因按照先后顺序依次出现，并且基因之间有很强的关联性和排他性[5,6]。基因突变可能在造血干细胞水平上引起克隆优势，多种基因突变与临床表型密切相关，主要归因于造血干细胞的不断自我更新和髓系肿瘤细胞的特异性分化[7]。

既往文献证实，亚洲人群中最常见的染色体核型异常为+8和20q-,并且U2AF1中S34F部位突变与+8和20q-密切相关[8],本研究结果与文献报道一致。有研究还指出，U2AF1还与其他剪切体因子突变互斥，剪接体编码基因突变在MDS 的发病机制中可能具有相同或相似的效应，其突变共存对于机体是致命的[9]。然而，本研究中仅有1例患者同时具有U2AF1和ZRSR2突变， OS仅8.7个月。国内外研究均证实了SF3B1是MDS预后良好的标志，突变型患者具有较长的生存期和较低的sAML转化率， MDS-RS中检出率约为65%,其他肿瘤仅5%[10,11]。本研究中低危和极低危组SF3B1突变检出率高于中高危组，10例SF3B1患者中6例临床分型为MDS-RS,突变型患者严重贫血更明显，机制可能为 MDS-RS患者骨髓中CD34+细胞的血红素及血红蛋白基因表达显著上调，但铁转运及血红蛋白关键基因剪切异常导致了红系细胞的终末分化异常，从而导致亚铁螯合酶出现异常，最终导致红细胞无法成熟，并且引起铁在线粒体中沉积。

MDS相关基因在不同性别和年龄组中存在差异，表明不同年龄阶段和性别人群中存在基因易感性。国外学者发现，男性患者中ASXL1、SRSF2、ZRSR2、RUNX1、DDX41、IDH2、TET2和U2AF1基因突变高发，而女性中DNMT3A和TP53基因突变更常见[12],本研究与上述文献报道结果一致。差异原因可能与男性DNA损伤途径增加、不同细胞对激素受体的反应程度以及不同性别免疫系统之间的差别有关。周葭蕤等[13]发现，老年组MDS发生可能与随年龄增长的进行性造血功能衰退和突变积累有关；而儿童组可能存在遗传易感因素，在此基础上不需要或积累较少的体细胞基因突变即可发生MDS,并且短时间内进展为sAML。

Nazha等[14]研究发现，MDS患者性别、初诊时年龄、Hb、PLT、骨髓原始细胞比例、IPSS-R预后评分、染色体核型和基因突变均为影响MDS患者预后的独立因素。其中SRSF2、U2AF1、ASXL1、RUNX1和TP53提示预后不良，而SF3B1提示预后良好[15]。ma-TP53突变常与TET2、SF3B1、ASXL1、RUNX1、SRSF2、JAK2、BCOR和CBL突变共存。与ma-TP53突变患者相比，bi-TP53突变患者PLT更低、骨髓原始细胞比例和进展为sAML机率更高。随着ma-TP53共突变数量增加，OS逐渐缩短，而bi-TP53突变患者5年OS均小于6%[16]。2022年美国血液学学会指出，bi-TP53突变患者较ma-TP53突变和wt-TP53患者OS更短。然而ma-TP53突变不能独立调控MDS或AML转化，也不能预测不良预后，该类患者对治疗的反应与wt-TP53患者比较无差异。这些证据说明ma-TP53突变本身不足以诱发MDS,需要其他的额外驱动基因突变或bi-TP53突变来共同促进恶性肿瘤的发生。

近年来，HMA是较高危MDS的常用治疗药物，约50%患者对HMA有反应，对HMA治疗有反应的患者多数会进展为sAML。HMA治疗失败后，中位OS为4-6个月[17]。Ball等[18]研究发现BCL-2抑制剂venetoclax联合HMA治疗44例MDS患者的总体反应率为59%,中位OS为19.5个月。其中26例MDS患者接受HSCT后，16例获得完全缓解，表明在venetoclax联合HMA治疗后的HSCT能明显延长MDS患者生存期。

总之，越来越多证据表明基因突变参与了MDS的发病及进展，在疾病诊断、疗效评估、白血病转化、预后分层等方面有重要的意义。本文简述了MDS基因突变与临床表型、预后之间的关系，但由于是单中心研究，样本量较少，结果存在局限性。未来仍需更多研究明确基因突变与MDS发病机制、疾病进展及靶向药物疗效评价的关系，为MDS患者制定个体化治疗提供依据。

参考文献:

[9]赵文舒,张银田,江千里,等.骨髓增生异常综合征患者U2AF1基因突变特征与临床表现及预后的相关性.中国实验血液学杂志,2020,28(6):1977-1984.

[11]丁宇斌,唐玉凤,唐旭东.骨髓增生异常综合征相关基因突变的研究进展.临床与实验病理学杂志,2021,37(2):198-200.

[13]周葭蕤,王芳,刘铭,等.MDS及MDS/AML患者基因突变与年龄相关性分析.中国实验血液学杂志,2020,28(2):567-571.

基金资助:甘肃省自然科学基金(18JR3RA356);

文章来源:张婉婉,张雅丽,任崇崇等.骨髓增生异常综合征患者基因突变与临床特征相关性及预后[J].中国实验血液学杂志,2024,32(01):176-183.