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植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中的保护效果研究

2024-07-15 82 上传者：管理员

摘要：目的探究植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中对目标核酸的保护效果。方法分别提取绿萝、水稻、竹子3种常见植物中的RNA作为载体RNA,同时以商业试剂Takara载体RNA为对照，提取甲型流感病毒（Flu A）、乙型流感病毒（Flu B）、呼吸道合胞病毒A型（RSV A）核酸，并利用实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）定量分析提取得到的病毒核酸浓度，以评估植物RNA在核酸提取中对病毒核酸的保护效果。结果经琼脂糖凝胶电泳检测，所提取植物RNA的28S rRNA、18S rRNA条带清晰明亮，无弥散现象，所得RNA具有良好的完整性。且经验证，植物RNA对病毒核酸扩增无干扰。裂解液中分别加入0、1000、3000、5 000、7 000、9 000 ng绿萝RNA进行Flu A RNA提取时，提取物经RT-qPCR扩增后的Ct值分别为35.06±0.14、33.01±0.42、32.45±0.33、31.95±0.34、31.74±0.28、31.92±0.24,使用Takara载体RNA提取核酸的Ct值为31.96±0.34。Ct值随着绿萝RNA添加量增加而降低，当添加量≥5 000 ng时，Ct值接近使用Takara载体RNA的提取组，继续提高绿萝RNA用量，Ct值趋于稳定，且与使用TaKaRa载体RNA的Ct值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。添加5 000 ng绿萝RNA与添加0 ng绿萝RNA相比，Ct值相差3.11,根据浓度差等于2ΔCt计算可知添加5 000 ng绿萝RNA提取得到的Flu A核酸浓度比不添加载体RNA高了8.63倍。进一步研究发现，添加绿萝RNA、水稻RNA、竹子RNA及Takara载体RNA,提取得到的Flu A、Flu B和RSV A核酸经RT-qPCR扩增后得到的Ct值与不添加载体RNA比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。绿萝RNA作为载体RNA在提取Flu A、Flu B、RSV A混合病毒核酸时，对比无载体RNA的对照组，分别降低了2.61、2.90、1.45个Ct值，即添加了绿萝RNA后提取Flu A、FluB、RSV A所得的核酸浓度分别提高了6.11、7.46、2.73倍。且添加了水稻RNA和竹子RNA提取混合病毒核酸所得的核酸浓度也分别至少提高了2.63倍和2.60倍。结论在病毒核酸提取过程中植物RNA具有保护病毒核酸的作用，可以提高提取得到的目的病毒RNA浓度，可用作病毒核酸提取时的载体RNA,为核酸提取中的载体RNA选择提供更多来源。

关键词：
核酸保护
植物RNA
病毒RNA提取
病毒检测
载体RNA
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核酸是储存、复制和传递遗传信息的主要物质[1]。实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)是分子诊断的主流技术，除前期的样本采集、转运、灭活等处理步骤，核酸检测产品在检测过程中主要有2个步骤：核酸提取和扩增。核酸检测的灵敏度直接取决于核酸提取效率，因此，高效的病毒核酸提取是病毒检测的基础[2,3,4,5]。核酸提取过程中，载体RNA作为一种核酸沉淀的辅助物质[6],对核酸提取效率有促进作用[7,8]。在柱纯化微量核酸的过程中，离心管壁的材料大多为聚丙烯，管壁上有静电，会吸附核酸，而载体RNA可以很好地被吸附到纯化柱上，能有效地去除静电效应，使自身被降解从而保护靶标RNA的完整性，减少靶标核酸物质因管壁吸附而造成的损失[9],进而提高微量核酸提取效率。同时，载体RNA的使用可降低提取环境中的核糖核酸酶降解靶标RNA的概率。在纯化核酸过程中添加微量的载体RNA可提升核酸沉淀效率，进而达到提高提取效率的目的。目前用于提取RNA的载体RNA 主要有多聚糖、核酸混合物及线性化丙烯酰胺3类[10,11,12,13,14,15],其中，核酸混合物一般是PolyA尾、大肠埃希菌RNA、酵母RNA、转运RNA等[16,17]。待测样品中检测靶标的扩增引物与载体RNA 同源性较高时，容易造成假阳性检测结果，需要重新设计引物解决假阳性检出问题。植物RNA与病毒等微生物核酸无同源性，理论上可以避免因载体RNA带来的假阳性检测结果，但是以植物RNA作为载体RNA的研究报道较为少见。因此，本研究随机选取并提取了绿萝、水稻和竹子3种常见植物的RNA,将其作为载体RNA分别应用于甲型流感病毒(Flu A)、乙型流感病毒(Flu B)和呼吸道合胞病毒A型(RSV A)3种呼吸道病毒的核酸提取，采用实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)检测核酸浓度，并评价其对靶标核酸的保护作用，以期为临床提供参考依据。现报道如下。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 生物材料

所用病毒毒株(Flu A、Flu B、RSV A)均由广州万孚生物技术股份有限公司提供。

1.1.2 仪器与试剂

仪器：Centrifuge 5418 R 高速冷冻离心机(Eppendorf公司)、NanoDrop One超微量分光光度计(Thermo Fisher公司)、宏石SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石医疗科技有限公司)、Eppendorf ThermoMixer C恒温混匀仪(Eppendorf公司)。试剂：无核酸酶水(Thermo Fisher公司)、PCR反应混合液(广州万孚生物技术有限公司)、B518661柱式植物RNA抽提纯化试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒[宝日医生物技术(北京)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 植物RNA的提取

使用生工生物工程(上海)股份有限公司的B518661柱式植物RNA抽提纯化试剂盒提取绿萝叶片、水稻叶片、竹子叶片的RNA,使用NanoDrop One分光光度计进行植物RNA浓度和纯度的检测，所有操作均按照试剂盒说明书进行。

1.2.2 植物RNA的质量评估

取2 μL植物RNA,使用NanoDrop One分光光度计检测RNA浓度和纯度。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取植物RNA的完整性。

1.2.3 病毒核酸提取

使用植物RNA取代商业Takara核酸提取试剂盒中的载体RNA,其余所有操作步骤均按照试剂盒说明书进行Flu A、Flu B和RSV A的核酸提取，提取后将所得到的病毒核酸置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.2.4 植物RNA对病毒核酸扩增的干扰验证

将3种植物RNA等量混合并添加Flu A、Flu B和RSV A核酸进行RT-qPCR扩增。同时Flu A、Flu B和RSV A作为阳性对照，3种植物RNA混合物作为阴性对照，探究植物RNA对病毒核酸检测是否有假阳性干扰作用。荧光定量PCR扩增体系为：10 μL PCR反应混合液，Flu A、Flu B和RSV A的正向引物和反向引物用量均为500 nmol/L,探针用量分别为250、125、250 nmol/L,模板用量为2 μL,用无核酸酶水定容至30 μL。PCR反应程序：第1步，预变性，48 ℃、2 min; 第2步，反转录，95 ℃、30 s; 第3步：变性，95 ℃、5 s; 第4步：退火，60 ℃、25 s; 第3和第4步进行42个循环。引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物探针序列见表1。

表1 引物探针序列

1.2.5 植物RNA作为载体RNA的浓度优化

验证植物RNA作为载体RNA的应用效果。在其余试剂及参数保持不变的基础下，实验将Taraka试剂盒中的载体RNA(6 000 ng)替换为不同浓度的绿萝RNA,并以全组分商业Taraka 试剂盒为对照，进行Flu A核酸提取。提取后，采用RT-qPCR对提取的病毒核酸进行定量分析，并评估不同水平的绿萝RNA对病毒核酸的保护作用。

1.2.6 提取过程中植物RNA对病毒核酸保护性能评价

在提取单一病毒核酸的基础上，将Flu A、Flu B和RSV A 3种病毒混合在一管；分别采用5 000 ng 绿萝、水稻、竹子的RNA作为载体RNA对 Flu A、Flu B、RSV A进行混合病毒核酸提取，提取后进行RT-qPCR扩增，通过Ct值比较验证植物RNA用作载体RNA对病毒核酸的保护效果。

1.3 统计学处理

采用Excel2013、SPSS27.0软件进行数据处理与统计分析。符合正态分布的计量资料以x¯±s

表示，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 植物RNA提取与评价结果

植物RNA浓度和纯度的检测结果显示，A260/A280的比值均在1.9～2.1,纯度较高，无大量污染，符合下一步实验要求。同时，经琼脂糖凝胶电泳检测，所提取植物RNA的28S rRNA、18S rRNA条带清晰明亮，无弥散现象，所得RNA具有良好的完整性。见表2。

2.2 植物RNA对病毒核酸扩增的干扰验证结果

混有植物RNA的病毒样本扩增曲线与不含有植物RNA的病毒样本重叠，具有相同的Ct值，植物RNA混合物的RT-qPCR扩增反应未出现扩增曲线和Ct值。植物RNA对病毒核酸扩增无干扰。见图1。

2.3 植物RNA作为载体RNA的浓度优化结果

裂解液中分别加入0、1 000、3 000、5 000、7 000、9 000 ng绿萝RNA进行Flu A病毒RNA提取时，提取物经RT-qPCR扩增后的Ct值分别为35.06±0.14、33.01±0.42、32.45±0.33、31.95±0.34、31.74±0.28、31.92±0.24,使用Takara 载体RNA提取核酸的Ct值为31.96±0.34。Ct值随着绿萝RNA添加量增加而降低，当添加量≥5 000 ng时，Ct值接近使用Takara 载体RNA的提取组，继续提高绿萝RNA用量，Ct值趋于稳定，且与使用TaKaRa 载体RNA的Ct值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。其中，添加5 000 ng绿萝RNA与添加0 ng绿萝RNA比较，Ct值相差了3左右，根据浓度差等于2ΔCt可以得到添加5 000 ng绿萝RNA提取得到的Flu A核酸浓度比不添加载体RNA高了8倍。见表3。

表2 植物RNA提取与评价结果(x¯±s)

2.4 其他植物RNA对多重核酸提取的保护作用

添加载体RNA提取核酸后的RT-qPCR扩增曲线比不添加载体RNA明显靠前，其对应的Ct值相应减小，添加了不同植物RNA作为载体RNA提取的样本RT-qPCR扩增曲线近乎重叠，3种植物RNA作为载体RNA在核酸提取过程中对病毒核酸的保护效果近乎一致。添加绿萝RNA、水稻RNA、竹子RNA及Takara载体RNA,提取得到的Flu A、Flu B和RSV A核酸经RT-qPCR扩增后得到的Ct值与不添加载体RNA比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。绿萝RNA作为载体RNA在提取Flu A、Flu B、RSV A混合病毒核酸时，Ct值比未添加载体RNA对照组分别低了2.61、2.90、1.45个Ct值，根据浓度差等于2△Ct计算可知，添加了绿萝RNA后提取Flu A、FluB、RSV A所得的核酸浓度分别提高了6.11、7.46、2.73倍。添加了水稻RNA和竹子RNA所得的核酸浓度也分别至少提高了2.63倍和2.60倍。见图2。

图1 植物RNA对病毒核酸扩增的干扰验证结果

图2 植物RNA对混合病毒核酸提取的保护作用

表3 植物RNA作为载体RNA的浓度优化结果(x¯±s)

3、讨论

核酸在高盐、无水乙醇环境中溶解度很低，通过高速离心可发生沉淀。当核酸浓度很低时，微量的核酸不足以形成沉淀，而加入载体RNA可以通过增加核酸的量从而促进核酸沉淀，提高核酸富集效率[18,19]。另外，载体RNA在核酸提取过程中通过与离心管壁的结合，减少了微量靶标核酸在提取过程中因管壁吸附造成的损失，同时也降低了酶降解待提取核酸的概率[20,21]。因此，添加植物RNA,体现了双重保护机制，协同促进了病毒核酸的高效提取。

Ct值作为PCR扩增过程中的一个关键参数，其降低意味着达到设定阈值所需的扩增循环数减少，即初始模板核酸浓度较高。本研究发现，随着绿萝RNA的添加，提取得到的病毒核酸样本经RT-qPCR扩增的Ct值降低，这直接反映了添加植物RNA后所提取核酸浓度的提高，且添加最佳量绿萝RNA提取得到的Flu A核酸浓度比不添加Carrier阴性对照组可提高8倍以上，明显提高Flu A病毒核酸的提取效率。当绿萝RNA添加量达5 000 ng后，继续添加绿萝RNA的量，Ct值趋于稳定，相对于商业试剂盒中载体RNA用量(6 000 ng)明显减少，且保护效果与其持平。同样，研究发现，添加水稻或竹子等其他植物RNA作为载体RNA,也取得了同样的核酸提取保护效果，核酸样本经PCR扩增后所得到的Ct值明显小于不添加植物RNA的提取样本，且与Takara商用核酸提取试剂盒中的载体RNA效果一致，说明植物RNA对病毒核酸提取的保护作用具有广泛性，推断其他常见植物的RNA也可以在核酸提取中起到保护目标核酸的作用，进一步拓宽了核酸提取试剂盒载体RNA的来源。

从临床应用的角度来看，病毒核酸的高效提取有助于提高病毒检测的灵敏度。在病毒感染早期，病毒载量往往较低，此时如果核酸提取效率不高，很容易导致漏检。而使用植物RNA作为载体RNA可以明显提高微量核酸的提取效率，使得在感染早期就能检测到病毒，为临床提前干预提供了有力支持。另一方面，植物RNA作为载体RNA的优势在于其与病毒等微生物核酸无同源性，因此，可避免同源性可能带来的假阳性检测结果，这对于临床检验结果的准确性具有重要意义。

基金资助:国家自然科学基金青年基金项目(82202582); 广东省即时检测(POCT)企业重点实验室(2021年度)项目(2021B1212050016);

文章来源:江嘉琦,李江峰,彭运平,等.植物RNA作为载体RNA在病毒核酸提取过程中的保护效果研究[J].检验医学与临床,2024,21(13):1875-1879+1884.