他克莫司（tacrolimus）又名FK506，是一种从筑波链霉素培养基中分离提取获得的大环内酯类强效免疫抑制剂[1]，自上市以来广泛应用于肝、肾移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗，目前在临床上越来越多地用于激素依赖型、激素耐药型和频复发型肾病综合征的治疗[2]，并取得良好的疗效。他克莫司口服吸收不完全，生物利用度为4%～89%，主要在小肠吸收并广泛分布于各个组织中，吸收入血后75%～80%的药物与红细胞强力结合，10%～25%与血浆蛋白结合。该药主要经肝脏CYP450酶系代谢，约95%代谢产物通过胆汁排泄，仅有约0.5%的药物以原型随粪便和尿液排出[3,4]。他克莫司的治疗窗狭窄，生物利用率个体差异大，价格较昂贵，限制了其在临床中的应用。五酯胶囊是由华中五味子经醇提法制备获得的有效成分混合物，主要活性成分为五味子甲素[5]，可以提高患者体内他克莫司的血药浓度和生物利用度[6,7]，从而减少他克莫司的用药剂量，减轻患者经济负担，且具有较好的安全性[8]。目前，国内外少有研究采用群体药动学（PPK）建模结合蒙特卡洛模拟法定量分析五酯胶囊对患儿体内他克莫司药动学的影响。本研究拟采用非线性混合效应（NLME）程序考察五酯胶囊对他克莫司药动学参数的影响，并应用蒙特卡洛模拟法探索联用五酯胶囊前后他克莫司的给药剂量，为临床个体化给药提供一定的理论依据。

资料与方法

病例资料

回顾性收集2015年12月至2019年3月于武汉儿童医院肾内科采用他克莫司治疗并定期监测血药浓度的肾病综合征患儿资料。纳入标准：（1）年龄<18岁，性别不限；（2）符合中华医学会儿科学分会肾脏病学组发布的指南中肾病综合征的诊断标准[9,10];(3）至少2周未调整他克莫司剂量以维持稳态血药浓度者。排除标准：（1）用药依从性不佳者；（2）因严重不良反应或其他原因中断治疗者；（3）他克莫司血药浓度低于定量下限者；（4）严重肝、肾功能不全或发生严重感染者；（5）存在临床医师或研究人员认为不适合纳入研究的其他因素者。

最终共纳入198例患儿，根据是否合用五酯胶囊将所有患儿分为未联用组（未用五酯胶囊，n=128）和联用组（联用五酯胶囊，n=70）。

给药方案

根据不同的病理分型选择合适的治疗方案，治疗药物主要包括免疫抑制剂（他克莫司，每粒0.5 mg，杭州中美华东制药有限公司，国药准字H20094027）和糖皮质激素（泼尼松、甲泼尼龙）必要时采用五酯胶囊（每粒含五味子甲素11.25 mg，四川禾正制药有限责任公司，国药准字Z10983013）辅助治疗。所有患儿均口服他克莫司起始剂量为0.05～0.10 mg·kg·d-1，间隔12 h 1次，疗程为12～24个月。初次服药一周后检测血药谷浓度，根据血药浓度调整剂量；用药期间对血药浓度进行监测，使其维持在5～10μg·L-1的治疗窗范围内。

检测指标

1.临床和实验室检查指标

记录患儿的一般情况（年龄、性别、体重等）、用药信息（服药剂量、合并用药情况等）以及治疗过程中的血常规，肝、肾功能指标，包括血细胞比容（HCT）、血红蛋白（HGB）、尿素氮（BUN）、血清肌酐（Scr）、尿酸（UA）、血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys-C）、总胆红素（TBIL）、血清总蛋白（TP）、丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）；肾小球滤过率（GFR）采用Schwartz公式计算获得[11]。

2.血药浓度监测

所有患儿均在连续服药7 d以上血药浓度达稳态后采集静脉血1～3 mL于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中，记录给药时间和采血时间点以获得准确的时间间隔。采用酶增强免疫测定技术（EMIT）进行他克莫司全血浓度测定。所用仪器为Viva-E Syva药物浓度分析系统，试剂为配套的Emit2000他克莫司检测试剂盒、样本萃取液、质控样品和定标液，均由德国Siemens公司提供。检测时严格按照试剂盒说明书进行操作。该检测方法的线性范围为2.0～30.0μg·L-1，定量下限为2μg·L-1，日内精密度和日间精密度均<20%。

PPK模型的建立

本研究采用Phoenix®NLME程序（Version 8.1,Pharsight Corporation,USA）进行PPK分析，应用R软件（Version 3.5.1,http://fahf7258c945db524541a97c44c3c9fa4c1bsuf0wow5xu99f6k5c.fyay.oca.swupl.edu.cn/）进行辅助绘图和可视化评价。药动学和统计学结构模型的筛选采用扩展最小二乘法。

1.药动学模型

由于本研究纳入数据均为血药谷浓度数据，故无法对口服生物利用度和吸收延迟时间进行估算。吸收速率常数（Ka）根据文献报道[12,13,14]固定在4.48 h-1，并约定本研究中的清除率（CL）和表观分布容积（Vd）均已包含口服制剂生物利用度[15]。根据患儿用药信息，分别试用一房室和二房室模型来拟合个体药时曲线并预测观测时间点的血药浓度值。通过作图比较预测值与实测值之间的残差变异，同时计算备选模型的各项相关参数，以评价模型的整体拟合优度。根据数据拟合情况结合相关参考文献确定合适的药动学模型。

2.统计学模型

采用指数模型描述药动学参数的个体间变异（式1），分别试用加法模型（式2）、指数模型（式3）、比例模型（式4）和混合模型（式5）来描述参数的个体内变异。

公式1

公式2

公式3

公式4

公式5

式（1）中Pi为第i个受试者的药动学参数，θi为该药动学参数的群体典型值，ηi是均数为0、方差为ω2且呈正态分布的个体间变异参数；式（2）至式（5）中Y为血药浓度实测值，IPRED为模型个体预测值，ε为残差变异。εn符合均数为0，方差为σ2的正态分布。3协变量筛选和最终模型的建立在初始结构模型的基础上采用逐步回归法（stepwise）筛选协变量，通过正向纳入（forward inclusion）和反向剔除（backward elimination）两个过程考察所有协变量对药动学参数的影响。将拟合过程中最大似然值（maximum likelihood）对数的负二倍作为目标函数值（OFV），以OFV值最小作为拟合程度的整体衡量指标。在正向纳入阶段，将需要考察的协变量逐一纳入结构模型，若加入某一协变量后OFV下降值大于3.84（χ2分布，P<0.05,df=1）则将其加入到模型中，重复该过程至OFV值无显著改变，从而建立全量模型。然后进入反向剔除阶段，逐一剔除全量模型中的各个协变量，当OFV升高值大于6.63（χ2分布，P<0.01,df=1）时视该协变量有显著意义并予以保留，排除所有无显著意义的协变量后获得最终模型。筛选时还应考虑协变量的临床合理性及参数估算值的精确性。

本研究筛选的协变量中年龄、体重、身高、体表面积、服药剂量、血常规、肝和肾功能指标为连续型变量，采用中位数校正的幂函数模型进行考察（式6）；性别和合并用药情况为分类型变量，采用指数模型进行考察（式7）。在引入协变量之前绘制协变量矩阵图并进行相关性分析，避免将具有共线性的两个变量同时引入同一药动学参数中。

公式6

公式7

其中Covj为第j个协变量，Covmedian为协变量中位数值，θi为药动学参数的群体预测值，θ为群体典型值，θcov为该协变量对药动学参数的固定效应影响。4 PPK模型的评价本研究采用拟合优度（goodnessof-fit）作图，自举法（bootstrap）、正态化预测分布误差法（normalized prediction distribution error,NPDE）和直观预测检验法（visual predictive check,VPC）对最终模型进行评价。拟合优度图描述了模型预测值与原始数据的拟合程度，主要包括血药浓度实测值（observed concentration,DV）-个体预测值（individual prediction,IPRED）、血药浓度实测值-群体预测值（population prediction,PRED）、条件权重残差（conditional weighted residuals,CWRES)-PRED和CWRES-时间的散点图。自举法的基本过程为从n个原数据集中有放回地随机抽取n个观察值，组成一组新样本并估算该组样本的模型参数值，此过程重复1 000次后，将获得的模型参数估算值与最终模型参数值进行统计学比较以考察模型稳定性。NPDE和VPC均由蒙特卡洛模拟法产生1 000套模拟数据集，前者通过作图和统计学检验考察标准化预测误差的分布特征，后者则通过图形直观比较各时相预测值与实测值的重合度来评价模型的适宜性。本研究按是否联用五酯胶囊进行分组模拟，然后采用VPC分别考察最终模型在这两种给药方式下的预测性能。

蒙特卡洛模拟法

本研究应用蒙特卡洛模拟法评价以下12种他克莫司给药方案：（1）他克莫司单用，20、25、30、35、40、45、50μg·kg-1,bid;(2）他克莫司联用五酯胶囊，他克莫司2、4、6、8、10μg·kg-1,bid。在不同给药方案下分别运行蒙特卡洛模拟10 000次，模拟过程中清除率的均值和个体间差异均来自最终模型结果，并计算获得10 000个稳态谷浓度分布于治疗窗内外的中靶概率（probability of target attainment,PTA）。通过比较PTA的大小评估和确定最佳给药方案，稳态谷浓度落在治疗窗范围内的PTA越大且高于治疗窗的PTA越小则给药方案越好。

结果

患者资料

本研究共纳入198例患儿，年龄（7.1±3.6）岁，1.25～16.5岁，2组患儿的基本病例情况见表1。所有患儿中有70例（35.4%）联用五酯胶囊，32例（16.2%）合并应用甲泼尼龙，166例（83.8%）合并应用泼尼松。本研究共获取282个他克莫司血药谷浓度数据进行PPK分析，平均血药谷浓度为（4.84±2.78）μg·L-1，其中未联用组和联用组的采血点数目分别为181个和101个，他克莫司血药浓度-时间散点图见图1。

表1 2组一般资料

图1他克莫司血药浓度-时间散点图

PPK模型

1.基础模型

根据拟合结果和相关参考文献权衡比较后，最终确定一级吸收和一级消除的一房室模型能较好地阐述他克莫司在本研究群体内的药动学特征。个体间变异采用指数模型，个体内变异采用比例模型时拟合优度最佳。基础模型为：Ka(h-1)=4.48exp（ηCL）。其中ηVd和ηCL分别代表对应药动学参数的个体间变异。

2.协变量筛选和最终模型

被纳入考察的协变量包括：基本生理特征（年龄、体重、身高、体表面积）、血常规（HCT、HGB）、肝功能（TBIL、TP、ALT、AST）、肾功能（BUN、UA、Cys-C、Scr、GFR）以及合并用药情况（五酯胶囊、甲泼尼龙、泼尼松）。协变量矩阵图见图2，方框中的数值即为横纵坐标对应协变量的相关系数，相关系数>0.5可视为协变量之间存在相关性。在避免同时引入具有共线性的变量的前提下，根据加入协变量后OFV下降值的大小顺序，依次将协变量纳入以构建全量模型。在剔除其中无显著意义的协变量后，体重、AST以及联用五酯胶囊（Wuzhi）均被保留在最终模型中。最终模型的建立过程及统计学分析见表2。他克莫司PPK最终模型参数估算及自举验证结果见表3。最终模型表达式见式（8）至（10）。

公式8

公式9

公式10

式中θ1为体重WT对于Vd的固定效应参数，θ2为体重的自然对数值对于CL的固定效应参数，θ3为AST的自然对数值对于CL的固定效应参数，联用五酯胶囊时Wuzhi为1，反之则为0。当体重取中位数23 kg AST值取中位数18 U·L-1时，表观分布容积和清除率的群体典型值分别为Vd=88.41 L,CL=5.89 L·h-1

3.模型评价

最终模型的拟合优度图见图3。由血药浓度实测值（DV)-IPRED散点图和DV-PRED散点图可见，最终模型所产生的散点都较为均匀地集中分布在参考线两侧，证明预测误差无明显偏倚。CWRES-PRED散点图和CWRES-时间散点图显示，所有预测残差均在±3个标准差的范围内，表明预测值与实测值吻合度较高，最终模型预测准确性较好。1 000次自举验证获得的模型参数与最终模型参数比较见表3，结果显示自举验证所得的中位数与最终模型参数偏差均在±9%以内，且最终模型参数均落在Bootstrap参数的95%置信区间内，说明最终模型稳定性较高。NPDE验证结果图见图4，其中分位数-分位数图和直方分布图均显示NPDE符合正态分布；Wilcoxon符号秩检验、Fisher方差检验、ShapiroWilks正态分布检验和Global adjusted整体检验获得的P值分别为0.320、0.0816、0.292和0.245，可见三个统计学检验和整体检验的P值均>0.05，进一步证明NPDE具有方差齐性且符合正态分布。直观预测检验结果见图5,A图和B图中1 000次蒙特卡洛模拟生成的数据集与实测血药浓度数据集的中位数线大致吻合，实测浓度点基本落在预测浓度的90%置信区间内，说明最终模型对联用组和未联用组的预测性能均良好。

图2协变量矩阵图Age

表2最终模型的建立过程及统计学分析 

表3他克莫司群体药动学最终模型参数估算及自举验证结果

图3最终模型的拟合优度图

图4最终模型正态化预测分布误差法（NPDE）验证图

图5最终模型直观预测检验图

蒙特卡洛模拟

在预设的给药方案下运行蒙特卡洛模拟，获得他克莫司稳态血药浓度的预测值及其在治疗窗内外的PTA分布情况，12种给药方案的模拟结果见表4。其中他克莫司（35μg·kg-1,bid）未联用五酯胶囊治疗和他克莫司（6μg·kg-1,bid）联用五酯胶囊治疗方案落于治疗窗内的PTA较高（>80%），分别为81.43%和85.57%；且高于治疗窗的PTA较低（<10%），分别为9.91%和6.26%；稳态浓度预测均值分别为7.38μg·L-1和7.13μg·L-1。这两种方案符合优选条件，可视为最佳给药方案。

讨论

他克莫司作为一种新型免疫抑制剂，自1990年开始应用于难治性肾病综合征的治疗，其后显示出确切的临床疗效[16,17,18]。但其治疗窗较窄，不良反应与血药浓度呈明显相关性[19]，因此临床需要常规监测他克莫司血药谷浓度并使其维持在5～10μg·L-1的范围内，以达到安全有效的治疗目的[20]。早期研究证实五酯胶囊与其他和他克莫司联用的药物相比具有不良反应少且增效作用明显的优势[21]，联用他克莫司的治疗方式已普遍应用于国内的肾病综合征患者。但经验性用药常造成体内药物暴露量过高或不足，因此有必要在临床研究中结合PPK方法和仿真模拟技术，以实现特殊群体的联合用药效果的评价及个体化给药方案的制订，满足临床实际需求。

表4他克莫司在不同给药方案下的稳态血药浓度模拟结果

本研究采用NLME模型法成功获取了他克莫司在中国儿童群体中的药动学参数及变异，研究数据显示1～18岁中国儿童群体的他克莫司清除率群体典型值为0.26 L·h-1·kg-1，与黄凌斐等[14]报道的肾病综合征患儿的0.28 L·h-1·kg-1和WANG等[22]报道的0.25 L·h-1·kg-1基本一致，同时与LU等[23]报道的肾病综合征成人患者的0.20 L·h-1·kg-1较为接近但与HAO等[24]报道的肾病综合征患儿的清除率0.44 L·h-1·kg-1相比略偏小，可能是由于不同研究的病例数量差异较大，以及部分研究纳入的病例存在合并用药情况（唑类抗真菌药物、五酯胶囊）导致他克莫司CL下降。

影响他克莫司在人体内药动学过程的因素多样而复杂，其中较为常见的有体重、术后时间、HCT、肝功能以及遗传因素等[25]。本研究在经过协变量筛选后发现，体重、联用五酯胶囊和AST均为影响他克莫司CL的重要因素。体重是反映儿童生理发育成熟程度的重要指标之一，发育成熟度与药物清除能力呈正相关[26]。他克莫司大部分在肝脏经CYP3A酶系代谢，小部分在肠道代谢，绝大部分代谢产物经过粪便和胆汁排泄，因此肝功能的差异可能导致他克莫司CL的个体差异。由最终模型及其参数可知AST值与他克莫司CL呈负相关，但固定效应参数较小，说明AST对研究人群的CL影响程度有限，且本研究未纳入严重肝功能损伤的患儿，因此对于这类患儿如何调整给药方案尚待进一步研究。他克莫司作为CYP3A的代谢底物，若与诱导或抑制CYP3A酶活性的药物联合应用可影响其代谢，与他克莫司相互作用的药物主要包括部分抗菌药物、钙通道阻滞药、糖皮质激素以及中草药等[4,27]。本研究结果显示，五酯胶囊能大幅降低他克莫司的CL，而糖皮质激素（甲泼尼龙、泼尼松）对他克莫司的CL无显著影响。此外，有研究报道他克莫司与血浆蛋白结合率高达99%，全血药物浓度的增加可能使红细胞结合药物达到饱和，而药物浓度、HCT和血浆蛋白浓度等因素均可能影响药物在红细胞和血浆中的分配比例。故本研究将血生化指标HCT和HGB作为协变量纳入模型，但最终分析结果显示它们并未对他克莫司药动学过程造成显著影响，其原因可能是由于本研究人群的HCT值和HGB值基本在正常范围内波动。

在患者治疗过程中临床药师应根据血药浓度监测结果协助医师制订合理的给药方案，对于本研究群体他克莫司血药谷浓度可作为明确的药效学靶指标，因此最佳给药方案是以谷浓度是否落在治疗窗内的群体发生概率作为优选条件而获得，该统计学结果可为临床经验给药提供一定的参考。蒙特卡洛模拟结果表明，对于肾病综合征患儿的经验性治疗，可采用他克莫司（6μg·kg-1,bid）联用五酯胶囊，该方案与他克莫司单药治疗最佳方案（35μg·kg-1,bid）相比能够在保障治疗安全有效的同时大幅降低他克莫司的给药剂量。

综上所述，本研究成功建立了肾病综合征患儿口服他克莫司的PPK模型，定量考察了各种因素对其药动学参数的影响，并通过蒙特卡洛模拟对联用五酯胶囊前后的他克莫司给药方案进行了分析和优化。然而本研究作为回顾性单中心研究也存在一定的局限性，未将转运和代谢相关基因多态性纳入考察；且由于临床数据缺乏而未能建立药动学-药效学链接模型。下一步我们将继续以群体药动学/药效学研究为切入点，结合药物代谢酶和转运体基因组学，更深入地探讨他克莫司在中国儿童体内的药动学规律和药效学特征，为实现个体的给药方案疗效及不良反应的预测提供更可靠的理论依据。

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基金:国家自然科学基金青年项目(81600123);武汉市卫生计生委青年项目(WX17Z13)