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吴茱萸碱调节CCL2-CCR2信号轴对创伤失血性休克大鼠脑损伤和免疫功能的影响

2025-07-27 35 上传者：管理员

摘要：目的：探讨吴茱萸碱（EVO）调节趋化因子（CCL2）-趋化因子受体（CCR2）信号轴对创伤失血性休克（HTS）大鼠脑损伤和免疫功能的影响。方法：大鼠随机分为HTS组、EVO低（EVO-L,10mg/kgEVO）、中（EVO-M,20mg/kgEVO）、高剂量（EVO-H,40mg/kgEVO）组、EVO-H+CCL2组（40mg/kgEVO+5ngCCL2重组蛋白）及假手术组，干预结束后，试剂盒检测髓过氧化物酶（MPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、IL-6、TNF-α水平；HE染色检测脑组织形态学变化；免疫组化法检测β-淀粉样前体蛋白（β-APP）表达；流式细胞术定量检测T淋巴细胞亚群含量；Westernblot检测脑组织CCL2、CCR2蛋白表达。结果：与假手术组相比，HTS组神经元损伤严重，IL-6、TNF-α、MPO、MDA水平、β-APP阳性细胞比、CCL2、CCR2表达、CD8+T细胞显著升高，SOD水平、CD4+T/CD8+T、CD4+T、CD3+T细胞显著降低（P<0.05）；与HTS组相比，EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组大鼠脑组织形态学改善，IL-6、TNF-α、MPO、MDA水平、β-APP阳性细胞比、CCL2、CCR2表达、CD8+T细胞显著降低，SOD水平、CD4+T/CD8+T、CD4+T、CD3+T细胞显著升高，具有剂量依赖性（P<0.05）；与EVO-H组相比，EVO-H+CCL2组IL-6、TNF-α、MPO、MDA水平、β-APP阳性细胞比、CCL2、CCR2表达、CD8+T细胞显著升高，SOD水平、CD4+T/CD8+T、CD4+T、CD3+T细胞显著降低（P<0.05）。结论：EVO通过抑制CCL2-CCR2信号通路减轻HTS大鼠脑损伤，改善免疫功能。

关键词：
CCL2-CCR2
免疫功能
创伤失血性休克大鼠
吴茱萸碱
脑损伤
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脑血管疾病的发病率逐年上升，在全球范围内，其病死率位居各类疾病第二，致残率也处于较高水平，创伤性脑损伤（traumaticbraininjury，TBI）后的临床结局因伴有出血性休克显著恶化，脑血流量减少导致缺氧引起，病死率较高［1-2］。TBI发生后，大量失血引起的失血性休克（hemorrhagictraumaticshock，HTS）引起全身炎症、屏障破坏和多器官衰竭，引发免疫功能损伤，是导致死亡的重要危险因素［3］。HTS作用机制较为复杂，炎症和氧化应激是引发脑损伤的常见作用机制［4］。最新研究表明，各种趋化因子被确定是引发和放大创伤性出血性休克及液体复苏早期炎症反应的关键驱动因素，如趋化因子配体（CCchemokineligand2，CCL2）及趋化因子受体（CCchemokineligandreceptor2，CCR2）信号是潜在的靶向治疗TBI后炎症的新方案［5-6］。吴茱萸碱（evodiamine，EVO）是吴茱萸的主要药物成分，分子量为303.36，具有多种药理作用，包括抗癌、血管舒张、抗过敏和消炎等作用，因其毒性较低成为近年医学研究重点［7］。XU等［8］研究发现EVO可通过抑制氧化应激改善TBI预后，成为TBI治疗的潜在药物，但EVO对HTS的作用及机制鲜有报道。本研究旨在探讨EVO通过调节CCL2-CCR2信号通路对HTS大鼠脑损伤及免疫功能的影响。

1、材料与方法

1.1　材料　

1.1.1　实验动物　

雄性SD大鼠，6周龄，体质量210~240g，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号：SCXK（川）2020-030，置于温度22℃、12h/12h黑暗/光照循环的标准条件下，自由进食饮水。实验动物护理和使用按美国国立卫生研究院指南操作。本实验研究经四川司法警官职业学院伦理委员会批准（2022-051）。

1.1.2　试剂　

EVO（南京泽朗医药科技有限公司，纯度98%）；CCL2蛋白（R＆Dsystems）；髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、超氧化物歧化酶（super‐oxidedismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；IL-6、TNF-α试剂盒（上海森雄科技实业有限公司）；β-淀粉样前体蛋白（β-APP）、CCL2、CCR2一抗（Abcam公司）；CD3FITC、CD4PE、CD8PC5荧光标记抗体（Invitrogen/Caltag公司）。

1.2　方法　

1.2.1HTS大鼠模型制备及干预　

参照文献制备HTS大鼠模型［9］：大鼠喂养1周后，随机分为造模组（55只）及假手术组（10只），造模组大鼠经45mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，固定在手术台上，剪开侧腹股沟区皮肤，暴露皮下组织及左侧股动脉，大鼠血容量（ml）=体质量（g）×0.06ml/g+0.77ml，其中股动脉放血量约为血容量的35%；剪开颈部皮肤及皮下组织，暴露右侧颈总动脉，连接压力换能器进行持续血流动力学监测；用夹钳将大鼠股骨干1/3处进行开放性骨折，手中有骨摩擦感即完成股骨骨折操作；骨折完成后放血，10min平均动脉压降至35~45mmHg，继续放血或回输血液使血压维持90min，提示HTS完成。以2倍放血量复苏，复苏完成时间为30min内，逐渐缝合伤口，放回鼠笼。假手术组仅分离组织，不进行放血及骨折操作。造模过程中有5只大鼠死亡，其余50只随机分为HTS组、EVO低（EVO-L）、中（EVO-M）、高剂量（EVO-H）组、EVOH+CCL2组，每组10只；其中EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组分别灌胃10mg/kg、20mg/kg、40mg/kgEVO［10］；EVO-H+CCL2组灌胃40mg/kgEVO，同时腹腔注射5ngCCL2蛋白［11］；HTS组及假手术组均给予等体积生理盐水灌胃及腹腔注射干预，每天1次，连续干预1周。

1.2.2　样本采集　

干预结束后，戊巴比妥钠麻醉大鼠，收集静脉血用于免疫功能检测；另取大鼠右心室血液，室温孵育30min，1000g离心10min，将血清样本于‒80℃储存；断头取脑，取部分左侧脑组织用多聚甲醛固定，用于HE染色及免疫组化染色；右侧脑组织‒80℃储存用于Westernblot检测。

1.2.3　试剂盒检测血清炎症因子及氧化应激水平　

取血清样本，按照试剂盒说明书检测血清中MPO、SOD、MDA、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4HE染色检测脑组织形态学变化　

取固定在4%多聚甲醛中的脑组织，4℃下在0.1mol/LPBS中浸润48h，石蜡包埋，并在距前囟4mm处收集冠状切片。将组织块切5µm片并转移到载玻片上，用苏木精和伊红染色，脱水，盖玻片覆盖，光学显微镜下进行形态学检查。

1.2.5　免疫组化法检测

β-APP水平　收集脑切片，脱蜡后进行微波抗原修复，过氧化氢室温孵育后封闭，与β-APP一抗4℃孵育过夜，加入生物素化二抗反应，加入AB试剂和DAB试剂盒进行显色，脱水、透明及封片，每组取6个视野，ImageJ软件分析阳性细胞比例（阳性细胞数/总细胞数×100%）。

1.2.6　免疫功能检测　

收集大鼠全血，加入肝素抗凝，生理盐水稀释并加至淋巴细胞分离液面，1500r/min离心5min，可见试管分为4层；另取离心管，利用吸管收集中层与上层淋巴细胞于离心管中，生理盐水稀释，再次离心，最后舍弃上清，即可得到纯度较高的淋巴细胞；依次加入CD3FITC、CD4PE、CD8PC5荧光标记抗体，充分混匀，离心，去上清，流式细胞仪定量检测T淋巴细胞亚群含量。

1.2.7Westernblot检测脑组织CCL2、CCR2蛋白表达　

放射免疫沉淀缓冲液提取大鼠脑组织总蛋白，BCA检测试剂盒测定蛋白浓度，变性，将30g蛋白行10%SDS-PAGE电泳，转至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂牛奶室温封闭1h，与CCL2、CCR2一抗4℃孵育过夜，与二抗孵育1h，荧光系统检测蛋白表达。

1.3　统计学分析　

采用SPSS27.0软件分析数据。计量资料以xˉ±s表示，单因素方差分析用于多组间比较，以SNK-q检验进一步两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1EVO对各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平的影响　

与假手术组相比，HTS组大鼠IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05）；与HTS组相比，EVO-L组、EVOM组、EVO-H组IL-6、TNF-α水平显著降低，且具有剂量依赖性（P<0.05）；与EVO-H组相比，EVO-H+CCL2组IL-6、TNF-α水平显著升高（P<0.05，表1）。

2.2EVO对各组大鼠血清MPO、SOD、MDA水平的影响　

与假手术组相比，HTS组MPO、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低（P<0.05）；与HTS组相比，EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组MPO、MDA水平显著降低，SOD水平显著升高，且具有剂量依赖性（P<0.05）；与EVO-H组相比，EVO-H+CCL2组MPO、MDA水平显著升高，SOD水平显著降低（P<0.05，表2）。

2.3EVO对各组大鼠脑组织形态学的影响　

假手术组大鼠无明显损伤变化；HTS组神经元损伤严重，细胞萎缩；EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组大鼠脑组织形态学得到改善，细胞萎缩程度减弱，其中EVOH组趋于正常；但EVO-H+CCL2组神经元损伤较EVO-H组严重，细胞萎缩程度加深（图1）。

2.4EVO对各组大鼠脑组织β-APP水平的影响　　

如图2、表3所示，与假手术组相比，HTS组β-APP阳性细胞比例显著升高（P<0.05）；与HTS组相比，EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组β-APP阳性细胞比例显著降低，且具有剂量依赖性（P<0.05）；与EVOH组相比，EVO-H+CCL2组β-APP阳性细胞比例显著升高（P<0.05）。

表1　各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较

表2　各组大鼠血清MPO、SOD、MDA水平比较

图1　脑组织形态学变化

图2　脑组织中β-APP水平变化

表3　比较各组β-APP阳性细胞占比

表4　各组大鼠CD3+T、CD4+T、CD8+T及CD4+T/CD8+T比较

图3　各组大鼠脑组织CCL2、CCR2表达比较

表5　各组大鼠脑组织CCL2、CCR2表达比较

2.5EVO对各组大鼠免疫功能的影响　

与假手术组相比，HTS组CD8+T细胞显著增加，CD4+T/CD8+T、CD4+T、CD3+T细胞显著降低（P<0.05）；与HTS组相比，EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组CD8+T细胞显著降低，CD4+T/CD8+T、CD4+T、CD3+T细胞显著升高，且具有剂量依赖性（P<0.05）；与EVO-H组相比，EVOH+CCL2组CD8+T细胞显著增加，CD4+T/CD8+T、CD4+T、CD3+T细胞显著降低（P<0.05，表4）。

2.6EVO对各组大鼠脑组织CCL2、CCR2蛋白表达的影响　

与假手术组相比，HTS组CCL2、CCR2表达显著增加（P<0.05）；与HTS组相比，EVO-L组、EVO-M组、EVO-H组CCL2、CCR2表达显著降低，且具有剂量依赖性（P<0.05）；与EVO-H组相比，EVOH+CCL2组CCL2、CCR2表达显著增加（P<0.05，图3、表5）。

3、讨论

严重创伤是全球死亡和残疾的主要原因，创伤相关严重失血可导致失血性休克，进而导致机体处于缺血状态，当大量失血或休克持续太久而没有充分复苏时，可引发细胞代谢紊乱、炎症细胞活化和脑神经元细胞死亡，严重影响患者预后［12］。尽管迫切需要改善失血性休克结局，但治疗选择有限［13］，尚无有效药物及治疗方法。

中药吴茱萸是一种富含EVO和吴茱萸次碱的植物，其中EVO是一种喹诺酮生物碱，用于治疗心血管疾病、感染、炎症和肥胖症［14］。研究发现EVO可抑制链脲佐菌素引发的小鼠海马氧化应激和炎症细胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6）分泌，并通过减少1-甲基-4-苯基吡啶离子显示出对血脑屏障的高渗透性，从而发挥神经保护作用［15-16］。研究表明失血性休克后器官损伤可能由急性失血时炎症介质IL-6、TNF-α等引起的炎症反应及氧化应激导致［17］。本研究发现HTS大鼠神经元损伤严重，炎症因子（IL-6、TNF-α）、氧化应激（MPO、MDA、SOD）水平及β-APP阳性细胞比例显著升高，提示HTS大鼠脑损伤可能与炎症因子及氧化应激水平升高有关。EVO干预后神经元损伤得到改善，炎症因子、氧化应激水平及β-APP阳性细胞比显著降低，表明EVO可抑制HTS大鼠炎症反应及氧化应激，减轻脑损伤。HTS发生时，往往伴有患者免疫功能紊乱，甚至多器官功能障碍以及全身炎症反应［18］。本研究发现EVO干预后，CD4+T/CD8+T、CD4+T、CD3+T细胞显著增加，提示EVO可改善HTS大鼠免疫功能，使机体适应炎症因子及氧化应激水平变化。

趋化因子是TBI后炎症相关的重要介质，并调节趋化因子信号传导，特别是CCL2-CCR2信号通路，抑制该通路对TBI治疗有益［19］。LIU等［20］研究发现TBI大鼠中，吡啶-2-羧基通过抑制TBI诱导的CCL2上调发挥神经保护作用。本研究发现HTS大鼠脑组织CCL2、CCR2表达显著增加，提示激活CCL2-CCR2信号通路可能参与HTS发生，与WECHE等［21］研究结果吻合。吴茱萸长期以来被用作传统中草药，目前广泛用于治疗呕吐、感冒头痛、腹痛和血液循环减少，EVO是吴茱萸的活性成分，早期研究表明EVO可阻断光诱导的趋化因子CCR1、CCR2、CCR2表达，表现出抗动脉粥样硬化剂潜力［22］。EVO干预后，CCL2、CCR2表达被显著抑制，减轻了HTS大鼠脑损伤，改善其免疫功能，推测EVO通过抑制CCL2、CCR2表达提高HTS大鼠免疫功能，减轻炎症反应及氧化应激，发挥脑保护作用。为进一步验证推测，以CCL2重组蛋白进行回复验证，结果显示，CCL2逆转了EVO-H对HTS大鼠的保护作用，表明EVO可减轻HTS大鼠脑损伤，与抑制CCL2-CCR2信号通路有关。

综上，EVO可通过抑制CCL2-CCR2信号通路提高HTS大鼠免疫功能，降低炎症反应及氧化应激，起到脑保护作用，为HTS治疗提供了理论依据，但由于机制复杂，后续将增加更多实验进行验证。

参考文献:

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文章来源:何静宇,张璇,陈浩然.吴茱萸碱调节CCL2-CCR2信号轴对创伤失血性休克大鼠脑损伤和免疫功能的影响[J].中国免疫学杂志,2025,41(07):1720-1724.