巴西人参，又称珐菲亚参，隶属于苋科双子叶植物，广泛分布于巴西、厄瓜多尔、巴拿马等国的热带雨林地区。巴西人参的根部含有丰富的活性成分[1]，如皂苷、多糖、氨基酸、类固醇等，具有较高的营养价值，能够在抗炎、抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多个领域展现出显著的药理活性，对人体健康带来多方面的益处，因此在巴西被誉为“巴西仙草”[2-4]。研究表明，巴西人参提取物在改善修复生殖系统损伤方面具有显著作用[5]，能够通过调节小鼠睾丸的微结构重组，影响曲细精管的组织[6]。

生精障碍是男性不育的主要原因之一，它涉及精子生成的各个阶段，导致精子数量减少、质量下降或完全无精子。随着现代社会环境污染的加剧、生活节奏的加快、饮食习惯的改变以及心理压力的增大，生精障碍的发病率呈现上升趋势。生殖损伤不仅影响个体的生育能力，还可能对患者的心理健康和社会生活产生负面影响。目前，关于生精障碍的病因学研究认为，遗传因素、环境毒物、内分泌失调、感染、免疫异常、氧化应激以及生活方式等因素均可能参与其中[7-8]。

TM4细胞，作为一种与生殖系统密切相关的细胞类型，紧密附着于曲细精管的基膜上，其主要功能是为精原干细胞提供必要的生长、发育以及自我更新的细胞因子，从而保障精子生成过程的正常进行[9]。研究表明，睾丸支持细胞之间的连接功能一旦损伤，可直接影响精子的生成过程，导致生精功能障碍，进而成为导致男性不育的关键因素之一。因此，减轻TM4细胞连接功能损伤可能是预防和治疗男性生殖功能障碍的有效措施之一[10-11]。双酚A（BPA）被广泛用于聚碳酸酯塑料和金属罐内衬的环氧树脂生产、皮革处理，以及多种塑料制品（包括食品包装、儿童玩具等）[12-13]。此外，BPA亦能从某些牙科材料，如黏合剂和填充剂中浸出[14]。BPA对机体健康损害主要通过干扰细胞自噬、促进细胞凋亡、引起氧化应激和炎症相关通路[15]。研究表明，BPA能够诱导生精障碍，通过促进TM4细胞发生凋亡，从而对男性生殖系统造成损害[16]。

本文探究了不同提取溶剂提取的巴西人参总皂苷Pg1～Pg5对BPA诱导TM4细胞损伤模型的保护作用，并考察了Pg3对BPA诱导TM4细胞凋亡的改善情况。

1、材料

1.1　仪器　　

1000Y高速多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；Cary100型变温紫外分光光度计（安捷伦科技有限公司）；JHBE-50T型闪式提取器（上海钒帜精密仪器设备有限公司）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特仪器有限公司）；JNB-30002型电子天平（宁波群安实验仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗器（昆山舒美超声仪器有限公司）；低温冷却液循环泵（DSB-5/20）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器）；FD-1C-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；CLM-170B-8CO2细胞培养箱（新加坡EscoMicroPte.Ltd.公司）；MultiskanFC酶标仪（赛默飞世尔科技公司）；LE-SH800SA多功能流式细胞分选系统（日本索尼公司）。

1.2　试药及细胞　　

巴西人参购于宁波珐菲亚食品有限公司，经中国医学科学院药用植物研究所云南分所李海涛研究员鉴定为苋科植物巴西人参Pfaffiaglomerata（Spreng.）Pedersen的干燥根，采用高速粉碎机进行粉碎，过3号标准筛（50目，孔径0.3mm），得到巴西人参粉，备用。　　

人参皂苷Re（纯度：99.8%，上海融禾医药科技有限公司）；无水乙醇、甲醇、正丁醇（天津市北联精细化学品开发有限公司）；高氯酸（天津市鑫源化工有限公司）；冰乙酸（天津市永大化学试剂有限公司）；香草醛（天津市福晨化学试剂厂）；盐酸（北京市通广精细化工公司）；实验所用试剂均为分析纯；水为纯化水。DMEM/F12培养基（南通飞宇生物科技有限公司）；马血清（HS，新西兰NEWZERUM公司）；胎牛血清（FBS，德国PAN公司）；非必需氨基酸（NAAS）、噻唑蓝溴化四唑（MTT）、磷酸盐缓冲液（PBS）、二甲基亚砜（DMSO）（北京索莱宝科技有限公司）；0.05%胰酶（北京迈瑞达科技有限公司）；BPA（北京百灵威科技有限公司）；FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、一抗Bcl-2、Bax（沈阳万类生物科技有限公司）；β-actin（江苏亲科生物研究中心有限公司）。　　

TM4细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心平台，资源编号为1101MOUPUMC000298，传代情况为第10代，贴壁生长上皮样细胞。

2、方法

2.1　巴西人参总皂苷的提取　　

称取巴西人参粉20g，分别加入400mL水、30%乙醇、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇，回流提取1h，过滤，收集滤液；滤渣中再分别加入以上相应溶剂200mL，回流提取1h，过滤，合并滤液，加入其滤液重量2%的活性炭，脱色4h，抽滤后浓缩，冻干，得冻干粉，按照上述相应提取溶剂分别命名为Pg1～Pg5，保存备用。

2.2　总皂苷的检测

2.2.1　标准曲线绘制　

配制5%的香草醛-冰乙酸反应液及质量浓度为1mg·mL－1的人参皂苷Re对照品母液。分别移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL人参皂苷Re对照品母液置于6个1mL量瓶中，加入甲醇定容，混匀，得到不同浓度梯度的人参皂苷Re对照品溶液。分别移取0.5mL不同浓度对照品溶液，于1.5mL离心管中，70℃挥发至干。再加入0.2mL反应液及0.8mL高氯酸于1.5mL离心管中，55℃水浴20min。分别精密移取以上反应液200µL置于5mL离心管中，加入1mL冰乙酸，充分混匀，589nm下测定吸光度（A）。以A为纵坐标，人参皂苷Re质量浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.2　样本检测　

称取待测样品10mg溶解于1mL甲醇中，吸取0.5mL上清液于1.5mL离心管，70℃挥发至干，加入0.2mL反应液及0.8mL高氯酸，55℃水浴20min。吸取反应液200μL于5mL离心管中，加入1mL冰乙酸，充分混匀后，589nm下检测A值。根据A值代入标准曲线中计算总皂苷含量。总皂苷得率（%）＝（C×V×n）/m×100%。式中：C.测定样品总皂苷质量浓度（mg·mL－1）；V.提取液体积（mL）；n.稀释倍数；m.冻干粉称样量（mg）。

2.3　细胞实验

2.3.1　细胞培养　

将TM4细胞在含有5%HS、2.5%FBS及1%NAAS的DMEM/F12完全培养基培养，置于37℃，5%CO2恒温细胞培养箱，定期观察细胞状态并更换新鲜培养基。待细胞密度达70%～85%后，加入0.05%胰蛋白酶（不含EDTA，pH7.2～7.8）消化传代，培养至对数生长期用于后续实验。

2.3.2Pg1～Pg5对TM4细胞存活率的影响　

采用MTT法测定细胞活力。取生长状态良好且处于对数生长期的细胞，加入0.05%胰酶消化，收集细胞悬液，将TM4细胞以2×105个·mL－1的密度，每孔100μL接种于96孔板中，置于培养箱中培养24h，弃去旧培养基，分别加入100μL不同质量浓度[0（对照组）、50、75、100、150、200、250、500、1000μg·mL－1]的巴西人参总皂苷药液，作用24h后，每孔加入20μL5%MTT溶液，培养箱孵育4h，弃去培养基，每孔加入150μLDMSO，将96孔板置于酶标仪中，于590nm波长下测定每孔A值。以培养基作为空白，计算细胞存活率，细胞存活率（%）＝（测定组A值－空白组A值）/（对照组A值－空白组A值）×100%。

2.3.3BPA损伤TM4细胞模型建立　　

①配制BPA染毒溶液：精确称取2.28mgBPA粉末，溶于10mL培养基中制得1000μmol·L－1BPA储存液，以此储存液配制500、250、225、200、175、150、125、100μmol·L－1的染毒液，0.22μm无菌滤膜滤过除菌后，置于4℃保存备用。　　

②建立BPA诱导TM4细胞的损伤模型：将对数生长期细胞接种于96孔板并生长至适宜密度，弃去旧培养基，分别加入终浓度为500、250、225、200、175、150、125、100μmol·L－1染毒液处理24h，分为空白组（含药培养基），对照组（正常细胞＋培养基）和给药组（正常细胞＋不同浓度含药培养基），每组设置6个重复。染毒结束后，按照“2.3.2”项下方法测定A值。根据细胞存活率以及细胞状态等情况，综合确定BPA诱导TM4细胞损伤模型的最终浓度。

2.3.4MTT法检测

Pg1～Pg5对BPA损伤的TM4细胞存活率影响　通过MTT法测定不同浓度Pg1～Pg5对BPA损伤后的TM4细胞存活率的影响。待96孔板中细胞生长至适宜密度后，除空白组和对照组外，其余各组均加入100μL浓度为200μmol·L－1的BPA染毒液，染毒24h后弃去培养基，分别加入100μL质量浓度为50、100、200μg·mL－1（低、中、高浓度）的Pg1～Pg5药液，模型组及对照组加入基础培养基进行平行实验操作。按照“2.3.2”项下方法测定A值，计算各组细胞存活率。

2.3.5　流式细胞仪检测细胞凋亡情况　

通过流式细胞仪考察Pg3高浓度组对BPA损伤的TM4细胞凋亡情况。使用0.05%胰酶对细胞进行消化，收集细胞悬液，以2×105个·mL－1的细胞密度将TM4细胞接种于6孔板中，每孔2mL，置于5%CO2的细胞培养箱中37℃培养24h。除空白组外，模型组及Pg3给药组每孔加入2mL浓度为200μmol·L－1的BPA染毒液，培养24h后弃去旧培养基，模型组加入不完全培养基2mL，给药组加入200μg·mL－1Pg3给药溶液2mL，作用24h。弃去旧培养基，使用PBS清洗两遍后，加入胰酶消化，收集细胞至离心管中，1000r·min－1，离心5min，弃上清液，收集细胞沉淀。加入PBS，吹打均匀，进行细胞计数，每组收集5×105个细胞。加入250μLBindingBuffer，5μLFITC染料，10μLPI染料，混匀，于室温避光孵育15min。1h内上机检测。

2.3.6　蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白　

对造模给药后的TM4细胞提取蛋白质，采用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，取25μg蛋白样品进行电泳、转膜，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗（Bax1∶500，Bcl-21∶500，β-actin，1∶000）孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min，二抗孵育1h，TBST洗膜3次。配制化学发光检测试剂（试剂A∶试剂B＝1∶1），与膜孵育1min，曝光显影。

2.4　统计学分析　　

所有实验结果采用SPSS软件进行统计分析，用单因素方差分析进行组间比较检验。

3、结果

3.1　巴西人参总皂苷的含量　　

人参皂苷Re回归方程为y＝1.567x＋0.0948，R2＝0.9903，根据线性回归方程计算巴西人参总皂苷含量，结果如图1所示，巴西人参总皂苷含量从高到低依次为Pg3＞Pg2＞Pg1＞Pg4＞Pg5。Pg3提取物总皂苷含量最高为24.26%，Pg5总皂苷含量最低为13.78%。3.2　细胞实验结果3.2.1Pg1～Pg5对正常TM4细胞活力的影响　如图2所示，正常TM4细胞给予不同质量浓度（50～200μg·mL－1）的Pg1～Pg5作用24h后，与对照组相比，Pg1、Pg4、Pg5细胞存活率均呈下降趋势，Pg2细胞存活率均呈上升趋势，Pg3除75μg·mL－1均呈上升趋势。Pg3、Pg4给药质量浓度为1000μg·mL－1时，与对照组相比，细胞存活率差异有统计学意义，结合光学倒置显微镜对细胞形态和状态进行观察，其他浓度给药组可能与药物浓度过大致使渗透压变化有关。因此，选择不超过200μg·mL－1质量浓度的Pg进行后续研究。

图2　不同浓度Pg1～Pg5对正常TM4细胞活力的影响

3.2.2BPA损伤TM4细胞模型建立　

如图3所示，与对照组相比，BPA染毒液浓度小于125μmol·L－1时，BPA对细胞存活率影响较小，随着BPA暴露浓度升高，TM4细胞存活率呈下降趋势。经计算，TM4细胞IC50为220μmol·L－1。因此，选择BPA损伤TM4细胞模型的条件为：将细胞以2×105mL/孔的密度接种于96孔板，每孔100μL，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中贴壁培养24h，弃去旧培养基，每孔加入200μmol·L－1的BPA染毒液100μL损伤细胞24h作为后续细胞模型。

3.2.3Pg1～Pg5对BPA损伤后TM4细胞活性的影响　

由图4可知，与模型组相比，Pg1低、中浓度组，Pg2低、中、高浓度组，Pg3中、高浓度组及Pg5高浓度组可显著提高BPA损伤后的TM4细胞存活率。且由图4可知Pg3高剂量组改善效果最好。

3.2.4　流式细胞仪检测细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达　如图5所示，空白组TM4细胞呈梭形，外形不

规则，轮廓不清，细胞核呈椭圆形、三角形或不规则形。BPA损伤后，细胞皱缩呈圆球状，细胞脱落数量增加，胞体变小，细胞核皱缩。Pg3给药后细胞形态有所改善。

图3　不同浓度BPA对TM4细胞存活率的影响

图4Pg1～Pg5对BPA损伤的TM4细胞存活率影响

图5Pg3对BPA损伤的TM4细胞状态的影响

由图6A～6B可知，与模型组比较，Pg3给药组细胞凋亡率显著下降。　　

免疫蛋白印迹法检测，结果表明，与空白组相比，模型组Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加。经Pg3给药后，与模型组比较，Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达减少（见图6C）。

图6Pg3对TM4细胞凋亡变化及凋亡相关蛋白的影响

4、讨论　　

本研究初步探索了巴西人参总皂苷的最优提取工艺，确认最佳提取工艺为：使用50%乙醇进行回流提取、回流时间为1h、提取两次、液料比分别为1∶20和1∶10（g/mL），总皂苷含量为24.26%。相比之下，回流提取法优于低共熔溶剂提取法（总皂苷含量仅为6.26%）[17]。此外，细胞存活率结果显示，巴西人参总皂苷提取物对TM4细胞毒性较低。　　

研究表明，BPA能诱导TM4细胞凋亡，从而导致细胞损伤[18]，本研究使用BPA诱导TM4细胞损伤，经过Pg1～Pg5给药后，TM4细胞损伤情况有所改善。细胞在BPA损伤后，给予一定剂量的Pg3，细胞凋亡数量显著降低。这表明Pg可能通过抑制BPA诱导的细胞凋亡从而起到对TM4细胞的保护作用。　　

本实验显著提高了巴西人参总皂苷的提取效率与得率，并揭示了其改善BPA诱导的TM4细胞凋亡的潜在作用，可为巴西人参的深度开发提供科学依据。

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文章来源:刘佳,路娟,薛宏伟,等.巴西人参总皂苷对双酚A诱导的TM4细胞凋亡改善作用研究[J].中南药学,2025,23(05):1351-1356.