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宁夏某医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床分布及分子机制研究

2020-10-09 181 上传者：管理员

摘要：目的：分析宁夏地区某三甲综合医院临床标本分离耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）的分布及耐药情况，了解该院CRE耐药基因的主要流行现状，为临床抗感染治疗及医院感染防控提供参考。方法：收集2017年1月1日至2018年12月31日住院患者临床分离的CRE菌株，利用自动化仪器进行细菌鉴定和药物敏感性试验（简称药敏试验）检测，利用改良碳青霉烯酶灭活（mCIM）试验联合乙二胺四乙酸-碳青霉烯酶灭活（eCIM）试验检测耐药菌的表型，并采用PCR检测ESBLs(blaSHV、blaTEM）、碳青霉烯酶（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48）共7种主要的耐药基因，最后对数据进行统计分析。结果：临床标本共收集CRE菌株77株，主要为肺炎克雷伯菌52株、大肠埃希菌25株；标本来源主要为痰液、无菌中段尿及血液等；标本来源科室主要为肝胆外科、重症监护室（ICU）和急诊科；药敏试验表明77株耐药菌对β-内酰胺类药物的耐药率均大于95.00%，对喹诺酮类抗菌药物耐药率均为75.00%左右；mCIM试验阳性有58株，eCIM试验阳性有35株、阴性有23株。应用PCR检测耐药基因，ESBLs以blaTEM为主，检出率为49.35%,blaSHV检出率为23.38%；碳青霉烯酶基因以blaNDM为主，检出率为36.36%，其余blaKPC、blaOXA-48阳性率分别为24.68%、15.58%，未检测到blaVIM和blaIMP基因。测序发现28株blaNDM阳性菌中有10株为blaNDM-1,18株为blaNDM-5。结论：宁夏某医院CRE耐药基因检出率较高，CRE对常用抗菌药物耐药率高，应多部门联动加强对CRE的监测与防控，合理应用抗菌药物。

关键词：
抗菌药物
耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌
耐药性
药学
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20世纪80年代后期耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）出现以后，已经在所有有人居住的大陆上发现了CRE，并且这些微生物引起的感染发生率在21世纪的前20年中稳步增加[1,2]，是对公共卫生的最重大威胁之一[3]。为了解宁夏地区某三甲综合医院临床标本分离的CRE的分布及耐药情况，了解该医院CRE耐药基因的主要流行现状，本研究对住院患者临床分离的CRE菌株耐药情况进行分析，并对耐药基因进行检测，现将结果报道如下。

1、资料与方法

1.1菌株来源

收集2017年1月1日至2018年12月31日宁夏地区某三甲综合医院住院患者临床分离的CRE菌株。CRE纳入标准参见2015年美国疾病控制与预防中心颁布的标准（《医疗机构CRE防控指南》）。剔除同一患者相同部位分离的重复菌株。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705、肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1706、肺炎克雷伯菌ATCCBAA2146，均购自上海汉尼生物技术有限公司。

1.2仪器与试剂

M-H肉汤培养基和VITEK-2Compact全自动微生物鉴定仪为法国生物梅里埃公司产品；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；PremixTaq、DNAmarker购自宝生物工程（大连）有限公司；药敏纸片购自英国Oxoid公司；抗菌药物标准品购自大连美仑生物技术有限公司；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2）购自天津市大茂化学试剂公司。

1.3细菌鉴定及药敏试验

使用VITEK-2Compact全自动微生物鉴定系统（法国生物梅里埃公司）及其配套革兰阴性菌鉴定卡进行细菌鉴定和药敏检测。药敏结果判断标准严格按照美国临床和实验室标准化协会（CLSI)2018年标准进行判读。质控菌株药敏结果在控，研究菌株结果方可纳入数据分析。所得结果用Whonet5.6软件进行分析。

1.4表型试验和PCR耐药基因扩增及blaNDM亚型鉴定

将收集的每株CRE菌株同时进行改良碳青霉烯酶灭活（mCIM）试验和乙二胺四乙酸-碳青霉烯酶灭活（eCIM）试验联合检测。其中当mCIM试验结果为阳性时eCIM试验结果才有意义；当mCIM试验结果为阴性时，eCIM试验结果不作解释，具体方法及结果判读标准参照CLSI2018年文件标准。采用煮沸法提取菌株DNA模板，通过参照相关文献报道及NCBI网站设计并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，详见表1。对常见的耐药基因ESBLs(blaSHV、blaTEM）、碳青霉烯酶（blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-48）进行PCR扩增。PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。其中，基因型KPC、NDM阳性对照菌分别为本研究中经测序确认耐药基因的7、27号菌，基因型SHV、TEM、OXA-48的阳性对照菌为31号菌，阴性对照均为质控菌大肠埃希菌ATCC25922。

表1耐药基因引物序列、产物长度和退火温度

2、结果

2.1CRE菌株的鉴定结果及科室分布

共收集到CRE菌株77株，其中肺炎克雷伯菌52株（67.53%）、大肠埃希菌25株（32.47%）。77株耐药菌主要来自肝胆外科、重症监护室（ICU）和急诊科，分别占25.97%、14.29%和11.69%。见表2。

表2CRE菌株科室来源分布

2.2CRE菌株标本来源分布情况

77株CRE菌株标本来源主要为痰液、无菌中段尿、血液、胆囊及胰腺引流液等，见表3。

表3CRE菌株标本来源分布

2.3CRE菌株对临床常用抗菌药物的药敏结果

CRE对常用抗菌药物耐药率均较高，对β-内酰胺类药物的耐药率均大于95.00%，对喹诺酮类抗菌药物耐药率均在75.00%左右，对氨基糖苷类抗菌药物耐药率也较高，其中对阿米卡星的耐药率最低（19.48%）、敏感率最高（79.22%）。CRE菌株对常见抗菌药物耐药性见表4。

表4CRE菌株对抗菌药物的药敏情况[n(%)]

2.4CRE菌株表型试验与耐药基因检测结果

将77株CRE菌株进行mCIM与eCIM联合试验并对耐药基因进行PCR扩增，其结果见表5、图1、图2。77株CRE中，58株mCIM试验阳性，即产碳青霉烯酶，其中35株eCIM试验阳性，即产金属β-内酰胺酶；23株eCIM试验阴性，即产丝氨酸碳青霉烯酶。PCR扩增耐药基因结果中，ESBLs基因以blaTEM为主，检出率为49.35%,blaSHV检出率为23.38%；碳青霉烯酶基因以blaNDM为主，检出率为36.36%，其余blaKPC、blaOXA-48阳性率分别为24.68%、15.58%，未检测到blaVIM和blaIMP基因。另外，有5株同时携带blaKPC、blaSHV和blaTEM基因型；2株同时携带blaNDM、blaSHV和blaTEM基因型；2株同时携带blaNDM、blaKPC、blaOXA-48和blaTEM基因型；还有1株同时含有blaKPC、blaOXA-48、blaSHV和blaTEM基因型。对携带blaNDM耐药基因的阳性产物经测序和比对后，发现有10株为blaNDM-1,18株为blaNDM-5。

表5CRE菌株mCIM联合eCIM试验及耐药基因扩增结果

图1CRE耐药基因部分扩增结果

图2mCIM试验与eCIM试验部分结果

3、讨论

本研究收集宁夏地区某三甲综合医院77株CRE菌株，菌株主要以肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌为主。标本来源主要为痰液、无菌中段尿、血液、胆囊及胰腺引流液等，科室分布主要集中在肝胆外科、ICU和急诊科，另外烧伤与整形美容科、神经外科、新生儿科、感染疾病科等科室均有CRE菌株检出。本研究结果显示，检出的CRE菌株以肺炎克雷伯菌居多，原因可能有：第一，临床标本中来源于呼吸道的送检量大，而存在于呼吸道的病原菌以肺炎克雷伯菌为主；第二，这些CRE菌株主要来自肝胆外科及ICU，据患者病历资料显示，这些患者多有严重的基础疾病，免疫功能极度低下，有多部位感染倾向，使用抗菌药物种类多且周期长，并且多数患者还要接受各种有创操作性治疗，如气管切开、气管插管、中心静脉置管、留置导尿管等，这些都为CRE的定植和感染提供了易感条件。这与其他相关研究中的报道相符[4,5]。

本研究对CRE进行药敏试验，结果显示77株CRE菌株对临床上的常用抗菌药物明显耐药，对β-内酰胺类药物的耐药率均大于95.00%，对喹诺酮类抗菌药物耐药率均在75.00%左右，对氨基糖苷类抗菌药物也有一定的耐药率。目前，多黏菌素E被视为CRE菌株感染治疗中最后的选择，但耐药基因mcr-1的出现使临床治疗更为棘手[6]。下一步本课题组会对临床菌株进行mcr-1的PCR检测，明确其临床分布，为研发有效的各类碳青霉烯酶抑制剂并解决肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的现状提供可靠依据。

本研究通过对CRE进行耐药基因检测，发现ES-BLs基因中blaTEM(49.35%）检出率较高，blaSHV检出率为23.38%；碳青霉烯酶基因以blaNDM为主，检出率为36.36%，其余blaKPC(24.68%）、blaOXA-48(15.58%）均有检出，而未检测到blaVIM和blaIMP基因。该结果表明宁夏某三甲综合医院CRE的ESBLs基因以blaTEM为主；主要的碳青霉烯酶基因为blaNDM，与我国大部分地区[7,8]以KPC基因型流行为主不同，分析其原因可能与菌株来源和地理条件等因素有关[9]。说明细菌的耐药性具有地域差异性，不同地区耐药基因分布不同，因此，应该根据当地耐药菌的耐药特点来合理选择抗菌药物。另外，在本研究中，碳青霉烯酶基因blaNDM检测出blaNDM-1和blaNDM-5两种亚型，且以blaNDM-5亚型为主。2010年KUMARASAMY等[10]首次报道了NDM-1的出现，NDM-1是目前临床上最重要的金属酶之一，能水解除氨曲南以外的所有β-内酰胺类抗菌药物。自NDM-1被报道以后，世界各地现已报道有17种NDM亚型，不同NDM亚型在酶活性和致病性上可能有差别。2016年我国首次报道了产NDM-5的大肠埃希菌[11]，之后陆续出现关于blaNDM-5型耐药基因的报道，不同的blaNDM亚型由于其个别碱基的不同，可能导致其水解活性的差异。blaNDM亚型的出现表明blaNDM可能正处于快速进化过程中而导致其广泛传播。

本研究根据CLSI建议，首次将eCIM与mCIM联合试验对CRE菌株进行表型检测，结果显示77株CRE菌株中有58株产碳青霉烯酶，其中有35株产金属β-内酰胺酶，23株产丝氨酸碳青霉烯酶。同时参考碳青霉烯酶基因的基因型检测方法，两者检测结果相比较有差异。分析其原因：一方面可能表型试验存在假阳性与假阴性结果；另一方面本研究仅检测了5种常见的碳青霉烯酶耐药基因，可能耐药基因型覆盖面不全面，所以有待后续研究从基因水平进一步完善。本研究中，产金属β-内酰胺酶的CRE构成比较丝氨酸碳青霉烯酶偏高，然而目前临床上抑制β-内酰胺酶的主要药物有克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦，但其仅对几种丝氨酸类碳青霉烯酶有抑制作用。目前，新型抗菌药物头孢他啶/阿维巴坦对大多数ESBLs、丝氨酸β-内酰胺酶、头孢菌素β-内酰胺酶有抑制活性，但对新德里金属β-内酰胺酶没有活性[12]。因此，通过表型试验初步检测区分产金属β-内酰胺酶和丝氨酸碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌，对于制订合理优先使用抗菌药物管理计划有重要意义，可为新药的合理使用提供依据。

综上所述，CRE感染已是临床面临的较为棘手的问题之一，本研究通过对CRE的临床分布、耐药基因分型和耐药特征等进行分析检测，为全面了解医院肠杆菌科细菌的流行现状及耐药机制提供了依据，也为今后临床上更有效地控制CRE引起的感染暴发和流行提供更可靠的治疗依据。

参考文献：

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[5]由晓颜,孔繁荣,苏维奇.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的临床分布特点及耐药性分析[J].中国卫生检验杂志,2017,27(4):601-603.

[7]王素梅,张健东,王宇凡,等.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因分型[J].中华医院感染学杂志,2019,29(17):2566-2570.

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[12]张敬霞,贾天野,张树永,等.头孢他啶/阿维巴坦对耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的体外抗菌活性研究[J].中国抗生素杂志,2018,43(9):1109-1116.

茆永娟,伏慧,赵梅,贾伟.宁夏某医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床分布及分子机制研究[J].检验医学与临床,2020,17(18):2615-2619.