二苯乙烯苷化学名为2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷（2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-Ο-β-D-glucoside，以下简称“TSG”），易溶于水，是中药制首乌的主要活性成分，且其含量是制首乌质量控制的专属性指标[1]。制首乌为蓼科植物何首乌干燥块根的炮制加工品，具有补肝肾、益精血、壮筋骨、乌须发之效[1]。现代药理研究表明，制首乌及其活性成分TSG具有抗衰老、防治骨质疏松、改善血管性痴呆等作用[2,3]。本课题组前期发现，制首乌具有植物雌激素样作用，其水煎剂可调节去卵巢大鼠的生殖轴，亦能抑制雷公藤多苷对大鼠生殖功能的破环，且制首乌含药血清可促进人乳腺癌T-47D细胞的增殖[4,5,6]；且前期体内实验还发现，TSG能增加性未成熟小鼠的子宫系数，调节性激素水平，增强子宫雌激素受体（ER-α、ER-β）的表达，亦提示TSG具有雌激素样活性[7]。基于此，本课题组拟研究TSG对雌激素受体阳性[ER（+）]人乳腺癌T-47D细胞增殖及其ER表达的影响，以进一步探讨TSG的雌激素样作用及分子机制，为制首乌植物雌激素样作用的物质基础研究和临床应用提供实验依据，为雌激素依赖性肿瘤（如乳腺癌、子宫内膜癌）患者的治疗提供参考。

1、材料

1.1仪器

EclipseTS100型倒置显微镜（日本Nikon公司）；Synergy2型荧光/吸收光酶标仪（美国BioTek公司）；BB15型CO2培养箱（美国ThermoFisherScientific公司）；Mini-PROTEANTetra型电泳槽、ChemicDocTouch型超高灵敏化学发光成像系统、C1000TouchThermalCycler型聚合酶链反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；NanoPhotometer型超微量分光光度计（德国Implen公司）；Microfuge20R型高速冷冻离心机（美国Beckman公司）。

1.2药品与试剂

TSG对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号：J17O8Z45941，纯度：99.9%）；β-雌二醇对照品（β-E2，阳性对照，北京索莱宝科技有限公司，批号：521C022，纯度：≥98.0%);DMEM高糖培养液、无酚红DMEM高糖培养液、胰蛋白酶（美国Gibco公司，批号分别为8118240、2003881、1967534）；胎牛血清（FBS）、活性炭-葡聚糖苷处理的胎牛血清（CDT-FBS，以色列BiologicalIndustries公司，批号分别为1829596、1742900）；兔源β-肌动蛋白（β-actin）、ER-α抗体（美国CST公司，批号分别为4、6）；兔源ER-β抗体（美国Abcam公司，批号：GR3211677-6）；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(H+L）二抗（美国JacksonImmunoResearch公司，批号：139799）；青-链霉素双抗、CCK-8试剂盒、细胞裂解液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL化学发光试剂盒、快速封闭液（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为091818180923、013018181008、082018180910、081518180916、103018181030、0710181-80906、110818181108);TRNzolUniversal总RNA提取试剂、FastKing一步法逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司，批号分别为R6917、Q6214];PCR引物（序列及扩增片段长度见表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成；二甲基亚砜（DMSO）等试剂均为分析纯，水为双蒸水。

表1PCR引物序列及扩增片段长度

1.3细胞

ER（+）人乳腺癌T-47D细胞株由上海复祥生物科技有限公司提供。

2、方法

2.1细胞培养及预处理

将T-47D细胞置于含10%FBS、1%青-链霉素双抗的DMEM高糖培养液中，于37℃、5%CO2、相对饱和湿度的条件下培养（培养条件下同）。于试验开始前3d，用磷酸盐缓冲液（PBS,pH7.4）清洗2次后，替换为含5%CDT-FBS、1%青-链霉素双抗的无酚红DMEM高糖培养液继续培养，以进一步增加细胞对雌激素样物质的敏感性[8]。

2.2细胞增殖情况检测

采用CCK-8法检测。取“2.1”项下经培养且处于对数生长期的细胞适量，用PBS清洗2次，经0.25%胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM高糖培养液调整细胞密度，并按1×103个/孔接种于96孔板中，每孔总体积为150μL。培养24h待细胞贴壁后，将其随机分为空白组、β-E2组[1×10-8mol/L，以含DMSO、5%CDT-FBS、1%青链霉素、双抗的无酚红DMEM高糖培养基稀释（DMSO最终体积分数为0.0003%），浓度参考文献方法[9]和本课题组前期预试验结果设置；下同]和TSG不同浓度组（1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8mol/L，浓度参考本课题组前期预试验结果设置），每组设6个复孔。吸弃上清液，空白组加入含5%CDT-FBS、1%青-链霉素双抗的无酚红DMEM高糖培养液150μL，各给药组加入含相应药物以及5%CDT-FBS、1%青-链霉素双抗的无酚红DMEM高糖培养液150μL。分别于培养24、48、72h时，各孔加入CCK-8试剂15μL，于37℃孵育2h，使用荧光/吸收光酶标仪于450nm波长处检测各孔的吸光度（A），计算细胞增殖率：增殖率（%）=（试验组平均A值/空白组平均A值）×100%。上述试验重复3次。

2.3细胞中ER-α、ER-β蛋白表达情况检测

采用Westernblotting法检测。取“2.1”项下经培养且处于对数生长期的细胞适量，用PBS清洗2次，经0.25%胰蛋白酶消化后，以不含血清的DMEM高糖培养液调整细胞密度，并按1×106个/孔接种于6孔板中，每孔总体积为2mL。培养24h待细胞贴壁后，将其随机分为空白组、β-E2组（1×10-8mol/L）和TSG低、中、高浓度组（浓度参考“2.2”项下试验结果设置），每组设4个复孔。吸弃上清液，空白组加入含5%CDT-FBS、1%青-链霉素双抗的无酚红DMEM高糖培养液2mL，各给药组加入含相应药物以及5%CDT-FBS、1%青-链霉素双抗的无酚红DMEM高糖培养液2mL。培养48h后，收集细胞，经细胞裂解液裂解后，以12000r/min离心15min，取上清液按BCA法测定蛋白浓度。将蛋白于100℃变性5min后，取20μg行SDS-PAGE。电泳后转移至PVDF膜上，室温封闭15min，加入ER-α、ER-β和β-actin一抗（稀释度均为1∶1000),4℃孵育过夜；用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TBST）溶液清洗10min×3次，加入二抗（稀释度为1∶10000），室温孵育1h；用TBST溶液清洗10min×3次，经ECL显色后，于超高灵敏化学发光成像系统上成像。使用Image-ProExpress5.1软件分析，以相应蛋白与内参β-actin条带的灰度值比值作为目标蛋白的表达量。上述试验重复3次。

2.4细胞中ER-α、ER-βmRNA表达情况检测

采用RT-PCR法检测。取“2.1”项下经培养且处于对数生长期的细胞，按“2.3”项下方法培养、分组、给药，每组设3个复孔。培养48h后，收集细胞，参照TRNzolUniversal总RNA提取试剂说明书方法提取总RNA，使用超微量分光光度计测定其纯度（即A260nm/A280nm值，若该值为1.8～2.0即表明其纯度符合试验要求[10]）。参照FastKing一步法RT-PCR试剂盒说明书方法进行RT-PCR。反应体系（50μL）：总RNA2μL,2×FastKingOneStepRT-PCRMasterMix25μL,25×RT-PCREnzymeMix2μL，上/下游引物各1.25μL、无RNA酶的ddH2O18.5μL。反应条件：40℃逆转录30min;95℃预变性3min;94℃变性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s，共循环35次；72℃再延伸5min。扩增产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳后，于超高灵敏化学发光成像系统上成像。使用ImageLab5.2.1软件分析，以相应基因与内参β-actin条带的灰度值比值作为目标基因mRNA的表达量。上述试验重复3次。

2.5统计学方法

采用SPSS17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1TSG对T-47D细胞增殖的影响

与空白组比较，β-E2组和TSG各浓度组各时间点（除β-E2组48h外）的细胞增殖率均显著升高（P<0.05或P<0.01），且用药72h时TSG1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L组的细胞增殖率均显著高于β-E2组（P<0.05），详见表2。根据上述结果，本研究以1×10-8、1×10-6、1×10-4mol/L作为TSG的低、中、高浓度进行后续试验。

3.2TSG对T-47D细胞中ER-α、ER-β蛋白表达的影响

与空白组比较，各给药组细胞中ER-α、ER-β蛋白的表达量均显著升高，且TSG低浓度组ER-β蛋白的表达量显著高于β-E2组（P<0.05或P<0.01）。其中，β-E2组细胞中ER-α、ER-β蛋白的表达量分别增加了56%、29%,TSG低、中、高浓度组细胞中上述蛋白的表达量分别增加了61%、69%、30%(ER-α）和83%、28%、34%(ER-β），详见图1、表3。

3.3TSG对T-47D细胞中ER-α、ER-βmRNA表达的影响

与空白组比较，各给药组细胞中ER-α、ER-βmRNA的表达量均显著升高，且TSG各浓度组ER-αmRNA以及TSG低、高浓度组ER-βmRNA的表达量均显著高于β-E2组（P<0.05或P<0.01）。其中，β-E2组细胞中ER-α、ER-βmRNA的表达量分别增加了22%、27%,TSG低、中、高浓度组细胞中上述mRNA的表达量分别增加了52%、127%、41%(ER-α）和95%、26%、131%(ER-β），详见图2、表3。

表2TSG对T-47D细胞增殖的影响

注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与β-E2组比较，#P<0.05

Note:vs.blankgroup,*P<0.05,**P<0.01;vs.β-E2group,#P<0.05

图1TSG对T-47D细胞中ER-α、ER-β蛋白表达影响的电泳图

表3TSG对T-47D细胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA表达量的影响

Tab3EffectsofTSGonproteinandmRNAexpres-sionofER-αandER-βinT-47Dcells下载原表

表3TSG对T-47D细胞中ER-α、ER-β蛋白及其mRNA表达量的影响

注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与β-E2组比较，#P<0.05,##P<0.01

4、讨论

雌激素是女性体内重要的性激素，不仅能促进女性生殖器官发育、维持第二性征，而且在骨代谢、心血管活动和神经功能中也具有重要作用[11]。雌激素水平低下可引发一系列疾病，如骨质疏松、更年期综合征、心血管疾病等，严重影响了女性的正常生活；同时，长期应用雌激素替代疗法的副作用较多，且可增加雌激素依赖性肿瘤（如乳腺癌、子宫内膜癌等）发生的风险[11]。因此，不良反应少的植物雌激素逐渐受到学者的关注，现已成为相关研究的热点之一[12]。

图2TSG对T-47D细胞中ER-α、ER-βmRNA表达影响的电泳图

植物雌激素可与ER结合而发挥雌激素样作用，在调节ER表达水平的同时，亦可用于治疗骨质疏松、围绝经期综合征、心血管疾病、肥胖等症[12,13]。ER主要包括ER-α和ER-β，其中ER-α的亲和力及总体活性更高[14]。TSG是中药制首乌的主要活性成分，前期研究表明其在体内具有一定的植物雌激素作用。为进一步探讨该化合物雌激素样活性及作用机制，本课题组以ER(+)T47-D细胞（该细胞含有丰富的ER，易受雌激素或雌激素样物质诱导而增殖，是用于检测化合物雌激素样活性的常用细胞株[15]）为对象，以β-E2为阳性对照，通过体外试验初步考察了不同浓度TSG对细胞增殖和ER表达影响。

CCK-8试验结果显示，各给药组各时间点（除β-E2组48h外）的细胞增殖率均较空白组显著升高，且用药72h时TSG1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L组的细胞增殖率均显著高于β-E2组。这提示阳性对照药和TSG均具有促进T-47D细胞增殖的作用，且TSG(1×10-7、1×10-6、1×10-5mol/L）的作用持续时间可能较阳性对照药更长。在本研究过程中发现，TSG各浓度组细胞的增殖率均有先升高后降低的趋势，且在浓度为1×10-6mol/L(24、72h）时达到峰值；同时，TSG在1×10-8～1×10-4mol/L的浓度范围内均可显著促进T-47D细胞的增殖，故本研究最终选择了1×10-8、1×10-6、1×10-4mol/L作为TSG后续试验中的低、中、高浓度。

本研究进一步采用Westernblotting法和RT-PCR法分别测定了各组细胞中ER-α蛋白及其mRNA的表达情况。结果显示，各给药组细胞中ER-α蛋白及其mRNA的表达量均较空白组显著升高，且TSG各浓度组ER-αmRNA的表达量均显著高于β-E2组。这提示阳性对照药和TSG均可不同程度地上调ER-α蛋白及其mRNA的表达。值得注意的是，TSG各浓度组细胞ER-α蛋白表达量与β-E2组无明显差异，但其mRNA的表达量却显著升高，这可能与设计ER-αmRNA扩增引物时未包含变异片段，而β-E2可诱导引物外某些序列片段转录有关[16]。此外笔者还发现，在TSG1×10-8～1×10-4mol/L的浓度作用范围内，细胞中ER-α蛋白及其mRNA的表达呈先上升后下降的趋势，在TSG1×10-6mol/L（中剂量）时其增强上述指标表达的效果最明显，这可能与PE的双重调节作用有关，即低浓度协同、高浓度拮抗的拟/抗雌激素作用[17]。

本研究同法测定了各组细胞中ER-β蛋白及其mRNA的表达情况。结果显示，各给药组细胞中ER-β蛋白及其mRNA的表达量均较空白组显著升高，且TSG低浓度组ER-β蛋白表达量以及TSG低、高浓度组ER-βmRNA的表达量均显著高于β-E2组。这提示阳性对照药和TSG均可不同程度地上调ER-β蛋白及其mRNA的表达，且TSG低浓度的诱导作用普遍强于阳性对照药。值得注意的是，虽然高浓度TSG也可显著上调ER-βmRNA的表达，但其对蛋白的上调作用相对较弱，这可能是因为蛋白表达除受mRNA降解的影响外，可能还受蛋白自组装的影响，从而导致mRNA转录水平和蛋白翻译水平不同步[18,19]。此外笔者还发现，在TSG1×10-8～1×10-4mol/L的作用浓度范围内，细胞中ER-β蛋白呈先下降后升高的趋势，在TSG1×10-8mol/L（低剂量）时其增强上述指标表达的效果最明显。ER-β与ER-α变化趋势不同，这可能与两种亚型活性不同、应答不同有关[12]。

有文献指出，植物雌激素的活性较雌激素弱[12]，且本课题组前期研究也得出了类似结论[6]。但本研究结果却提示，TSG的雌激素样活性与β-E2无明显差异，甚至在某些浓度下还强于β-E2。笔者分析其原因，认为：其一，β-E2多以DMSO为溶剂，若DMSO体积分数超过0.2%则会产生细胞毒性[20]；其二，受试物TSG是单一化学成分，而本课题组前期研究以制首乌为对象，成分复杂，故作用强弱有所差异。

综上所述，制首乌活性成分TSG可诱导T-47D细胞的体外增殖，并可通过促进ER蛋白及mRNA的表达来发挥雌激素样作用。本课题组将在此研究的基础上，进一步探讨TSG对雌激素依赖性肿瘤细胞的影响，挖掘其雌激素样作用的具体机制，以期为制首乌药材及其活性成分的雌激素样作用的物质基础研究以及临床应用提供更多的实验依据。

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基金:国家自然科学基金资助项目(No.81460670);贵州省教育厅青年科技人才成长项目(No.黔教合KY字〔2017〕181);贵州省“中西医结合基础”重点学科(培育)项目(No.黔学位合字ZDXK〔2016〕25号);贵阳中医学院科研项目(No.贵中医科院内〔2016〕33号).