阿尔茨海默病是一种严重威胁老年人生命健康的中枢神经系统退行性疾病。目前，全世界约有5000万人患有AD，且患病人数逐年上升，预计到2050年AD患病人数会增加3倍以上[1]。传统中医认为，AD归属于中医“呆病”“神呆”“善忘”的范畴，其病机涉及脾胃虚弱、气血虚衰、痰瘀交阻、气血凝滞等[2]。现代医学研究表明，AD发病机制与氧化应激、胆碱能损伤、神经炎症等相关[3,4,5]。目前，治疗AD的药物主要为胆碱酯酶抑制剂，如多奈哌齐、美金刚等单一靶点药物，治疗效果不显著，因此寻找高效低毒、便于长期服用、有效延缓或治愈AD的新型药物已成为研究者的首要目标[6]。

传统中药及其提取物具有安全、不良反应少等特点，已被用于治疗AD新药的研发，并显示出良好的效果[7]。沙棘是胡颓子科植物沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟果实，味酸、涩，性温，归脾、胃、肺、心经，常用于脾虚食少、咳嗽痰多、瘀血经闭、跌扑瘀肿的治疗[8]。据《民族药成方制剂》记载，沙棘的成方制剂吉祥安神丸具有补气安神作用；《蒙医金匮》中记载有沙棘十七味散，主治胃、肾、肝等脏腑之瘀血症，与中医治疗AD患者时使用增补气血、化瘀血、充盈脑髓的药物相符[9]。本课题组前期研究表明，沙棘中含有多酚、油脂等活性成分，具有抗氧化、抗AD等作用[10]。因此，沙棘抗AD的作用，可能与其补气健脾、化痰祛浊、活血化瘀的药效相关[11,12,13]。

网络药理学是利用计算机科学、分子生物学、药学等学科的成果，对传统中药成分的潜在靶点、药理作用进行多基因、多靶点、多途径的系统研究，可为中医药现代化研究提供新的思路[14]。分子对接则是通过受体特征及受体与药物分子之间的相互作用方式来预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法[15]。本文采用网络药理学结合分子对接法对沙棘治疗AD的分子机制进行研究，阐明沙棘活性成分治疗AD的药理作用机制并进行初步的药理学实验验证，为沙棘在治疗AD方面的应用提供参考。

1、材料

1.1仪器

FA2004型电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；Morris水迷宫视频跟踪分析系统（成都泰盟科技有限公司）；FC型酶标仪[赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]；XH-C型漩涡混合器（无锡莱浦仪器设备有限公司）；JJ-12J型脱水机、JB-L7型包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；XSP-13C-LP型显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.2药品与试剂

氯化铝（AlCl3，天津市凯通化学试剂有限公司，批号：170814，分析纯）；D-半乳糖（北京化学试剂公司，批号：1711016，分析纯）；奥拉西坦胶囊（石药集团欧意药业有限公司，批号：485180416，规格：0.4g/粒）；肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（批号：2018011）、白细胞介素1β（IL-1β）试剂盒（批号：2011104）、IL-6试剂盒（批号：2018031）、IL-10试剂盒（批号：2017125）均购自碧云天生物科技公司。

沙棘购于佳木斯民生药行（批号：180312），经佳木斯大学药学院张宇教授鉴定为胡颓子科植物沙棘H.rhamnoidesL.的干燥果实，经石油醚回流提取，经高温水化法脱胶、高温淡碱法脱酸、活性白土脱色精制后，得沙棘果油提取物。沙棘用71%乙醇提取，得沙棘多酚提取物（多酚含量：56.25%）。以上提取物由佳木斯大学药学院药物化学实验室提供并测定。

1.3动物

清洁级KM小鼠60只，6周龄，体质量18g～22g，购自哈尔滨医科大学，动物使用许可证号：SYXK（黑）2014-003。小鼠饲养于SPF级动物实验室。

2、方法

2.1沙棘活性成分与相应靶点基因收集与筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台数据库中，以“沙棘”为关键词，以类药性（DL）≥0.18、口服生物利用度（OB）≥30%为条件对化学成分进行筛选，获取沙棘活性成分及对应靶点信息，然后在UniProt数据库获取靶点对应基因名，并下载活性成分的三维结构文件，得到沙棘的主要活性成分[16]。

2.2沙棘活性成分-疾病靶点网络构建

以“Alzheimer’sdisease”为关键词，通过人类基因平台（GeneCards）数据库（https：//www.genecards.org/）获取AD的相关靶点，使用R语言中Venny程序映射活性成分、预测靶点和疾病相关靶点，获得沙棘与AD的交集靶点，即为沙棘治疗AD的潜在靶点。将“2.1”项下获得的沙棘活性成分与沙棘治疗AD的潜在靶点，导入生物信息分析软件Cytoscape3.7.1，构建沙棘活性成分-AD靶点网络。网络中的节点（Node）表示靶点或化合物，边（Edge）表示活性成分与疾病之间相互作用。复杂网络节点中心性可用于衡量节点在网络中影响能力大小，以判断节点的重要性。其中，度值为重要参数，度值越高代表该成分或靶点在网络中的位置越重要。

2.3沙棘治疗AD靶点相互作用网络构建

将“2.2”项下映射后的沙棘治疗AD的潜在靶点导入蛋白质相互作用（STRING）数据库（https：//string-db.org/），将最低相互作用阈值调整为“中置信度（Mediumconfidence）”，其值为0.400，其余参数选择默认设置，获得靶点的相互作用关系数据，导入Cytoscape3.7.1软件中以“Networkanalyzer”插件制作靶点相互作用（PPI）网络[17]。选择度值排名靠前的沙棘治疗AD的潜在靶点作为关键靶点进行分子对接。

2.4分子对接

筛选“2.3”项下的关键靶点与“2.1”项下的沙棘活性成分，导入SYBYL-X2.1软件（https：//en.freedownloadmanager.org/Windows-PC/SYBYL-X.html）中进行分析、预测，评价沙棘活性成分与关键靶点之间的结合活性，并以分值来评价其结合活性：分值>4.25表示两者有一定的结合活性，分值>5.0表明有较强的结合活性，分值>7.0表明具有很强的结合活性[18]。

2.5GO分析与KEGG通路富集分析

将“2.2”项下沙棘治疗AD的潜在靶点导入Cytoscape3.7.1软件，使用“ClueGO”插件进行基因本体（Geneontology,GO）分析、京都基因与基因组百科全书通路富集分析。以P<0.05表示信号通路为显著富集。

2.6动物实验

2.6.1分组、造模及给药

选取50只小鼠随机分为空白组、模型组[皮下注射5%D-半乳糖溶液，120mg/（kg·d）；灌胃AlCl3溶液，20mg/（mL·d）]、阳性药物组[奥拉西坦，260mg/（kg·d）]、沙棘果油提取物组[按2015年版《中国药典》[8]人用剂量折算为小鼠等效剂量，即相当于生药量1.6g/（kg·d）；下同]、沙棘多酚提取物组[相当于生药量1.6g/（kg·d）]，每组10只。各组小鼠分别灌胃，给予相应药物的同时给予造模剂，空白组给予等体积的蒸馏水，每天1次，连续给药治疗60d。

2.6.2各组小鼠学习记忆能力检测

采用Morris水迷宫实验检测。（1）定位航行实验：给药结束后，以小鼠面向池壁放入水中至找到平台时间为逃避潜伏期。实验时间设置为120s，若超时未找到平台，则引导小鼠至平台停留片刻，将其逃避潜伏期计为120s。实验进行5d，每天训练1次，于第5天记录小鼠逃避潜伏期。（2）空间探索实验：于水迷宫定位航行实验第6天撤去水池中的平台，将小鼠面向池壁放入无平台的水池中自由游泳。实验时间设置为120s，记录120s内小鼠穿越原来平台位置的次数[19]。

2.6.3各组小鼠血清中免疫因子检测和海马体组织病理学变化观察

采用酶联免疫吸附（ELISA）法和苏木精-伊红（HE）染色检测。水迷宫实验结束后，各组小鼠禁食、自由饮水24h。然后将小鼠脱颈处死后，于冰台上迅速剥离大脑并取出海马体。取海马体的一半，制成10%海马组织匀浆液，4℃下以1000r/min离心10min，取上清液于4℃下保存，严格按试剂盒说明书测定海马组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的水平。另一半海马体用4%多聚甲醛固定，采用HE法染色，于100倍显微镜下进行图像采集分析，观察其病理结构[20]。

2.6.4统计学分析

采用SPSS20.0统计学软件进行实验数据分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1沙棘活性成分与其作用靶点

经DL≥0.18、OB≥30%条件筛选，获得沙棘活性成分33个，删除无对应靶点信息的活性成分后得到22个活性成分，主要包括多酚及油脂类成分，例如槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-胡萝卜素、β-谷固醇等，结果详见表1。22个活性成分共对应423个作用靶点，删除重复靶点后剩余213个作用靶点，包括AKT1、JUN、MAPK8、MAPK14等。

3.2沙棘活性成分-疾病靶点网络

由GeneCards数据库得到8731个AD相关基因，经R语言Venny映射，得到147个沙棘治疗AD的潜在靶点。建立的沙棘活性成分-AD靶点网络图中共包括171个节点及450条边，其中槲皮素、山柰酚、β-胡萝卜素、异鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇的度值较高，为主要活性成分，结果详见图1（图中，一个活性成分可对应多个靶点，如槲皮素对应IL-6、IL-1β、JUN等；一个靶点也可与多个活性成分相对应，如JUN对应槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等）。

3.3PPI网络

采用Cytoscape3.7.1软件构建的沙棘治疗AD靶点PPI网络图共包括129个节点及514条边，图中度值越大则节点颜色越深。度值排名靠前的靶点有AKT1、JUN、MAPK1、转录因子p65(RELA）、IL-6、MAPK8、MAPK14、表皮生长因子受体（EGFR）、c-fos原癌基因蛋白（FOS），结果详见图2。

3.4分子对接结果

表1沙棘活性成分

分子对接结果显示，沙棘主要活性成分与主要靶点蛋白的结合分值均在4.25以上，部分分值超过5.0、接近7.0；β-胡萝卜素对接JUN、MAPK1的分值甚至超过了7.0，表明其具有很强的结合活性，结果详见表2。

图1沙棘活性成分-AD靶点网络图

图2沙棘治疗AD靶点的PPI网络图

3.5GO分析和KEGG代谢通路富集分析结果

将147个沙棘治疗AD的潜在靶点进行GO富集分析，主要包括分子功能、细胞组成和生物过程3个部分。结果，上述靶点的分子功能集中于激活转录因子结合、抑制转录因子结合等；其细胞组成与小窝等相关性较大；主要参与了细胞对活性氧的反应、核受体活性、脂多糖介导的信号通路、神经递质的生物合成过程等生物过程，结果详见图3。

在KEGG代谢通路富集分析中，共富集到114条相关代谢通路（P<0.05），包括Toll样受体（TLRs）信号通路、IL-17信号传导途径、神经营养蛋白信号通路等，结果详见图4。

表2沙棘主要活性成分与主要靶点蛋白分子对接分值

图3沙棘治疗AD潜在靶点的GO分析图

图4沙棘治疗AD潜在靶点的KEGG分析图

3.6动物实验结果

3.6.1Morris水迷宫实验结果

与空白组比较，模型组小鼠逃避潜伏期显著延长（P<0.01），穿越平台次数显著减少（P<0.05），表明模型组小鼠出现学习记忆障碍，造模成功；与模型组比较，阳性药物组、沙棘果油提取物组和沙棘多酚提取物组小鼠逃避潜伏期显著缩短（P<0.05或P<0.01），穿越平台次数显著增加（P<0.05或P<0.01），结果详见表3。

表3各组小鼠学习记忆功能指标检测结果

注：与空白组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01

3.6.2大鼠海马体病理学观察结果

空白组小鼠海马体细胞排列整齐、紧密，细胞层次较多、结构清楚，细胞核形态完整、染色正常；模型组小鼠海马体细胞分布较稀疏、排列较散乱，出现大面积细胞坏死，有大量空泡，细胞核着色较深；与模型组比较，各给药组小鼠海马体细胞排列整齐、紧密，细胞层次增多，局部有少量细胞核染色加深，未出现空泡，细胞整体状态较好，结果详见图5。

3.6.3小鼠海马体组织中免疫因子检测结果

与空白组比较，模型组小鼠海马体组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，阳性药物组、沙棘果油提取物组及沙棘多酚提取物组上述水平含量显著降低（P<0.05或P<0.01），结果见表4。

4、讨论

在传统中医治疗中，对痴呆病症的认识相对较早，但是缺乏系统性的诊断标准[21]。中药网络药理学是融合系统生物学、生物信息学、计算机网络分析技术、蛋白组学等多个领域的新兴学科，可通过计算机构建网络模型对中药的整体作用进行分析，为中药的有效性和科学性提供理论科学基础，同时一步阐释中药多靶点协同作用的特点[22]。

本研究基于网络药理学对沙棘抗AD的作用机制进行探讨，发现沙棘抗AD共有22个活性成分，包括槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-谷甾醇、豆甾醇、β-胡萝卜素等。清代陈士铎在《辨证录》中指出：“治呆无奇法，治痰即治呆”，在中医治疗中考虑对AD患者化痰祛浊的治疗[23]。李学坚等[24]研究发现，芒果苷有抗炎和祛痰作用，槲皮素有抗炎作用但无祛痰作用，但两药在祛痰实验中有明显的协同效应，槲皮素能明显提高芒果苷的祛痰药效。因此，沙棘在治疗AD过程中，其活性成分槲皮素或可与其他成分相互作用而发挥化痰祛浊的作用。AD患者多由于年老体虚、肝血不足、血虚精少导致脾胃虚弱、气血虚衰，因而在AD的临床治疗中应当注意对患者气血的补充。边亚倩等[25]基于系统中药学的黄芪补气潜在功效标志物的研究，发现异鼠李素可通过改善物质代谢、调节机体免疫等方面发挥补气功效。因此，沙棘在治疗AD过程中，其活性成分异鼠李素可能发挥补气健脾作用。可见，对于瘀血内阻而气血精微不能上荣于元神者，治宜活血化瘀、醒脑开窍。赵文竹[26]在对玉米须功能因子活性评价及其降血糖机制研究中发现，甾醇类化合物具有抗凝血作用。因此，沙棘在治疗AD过程中，其活性成分豆甾醇或将发挥活血化瘀作用。

图5各组小鼠海马体病理学变化显微图（HE染色，×100)

表4各组小鼠海马体组织中免疫因子检测结果

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01

本研究对沙棘活性成分作用靶点与AD疾病靶点进行了交集分析，共发现147个关键靶点，这147个靶点可能是沙棘治疗AD的靶点。结合PPI网络与分子对接结果发现，AKT1、JUN、MAPK1、RELA、IL-6、MAPK8、MAPK14、EGFR、FOS是网络的关键靶点，且与沙棘活性成分具有较好的结合活性。其中，AKT1作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶编码蛋白，在神经系统发育中是一个关键的调控因子，用于神经细胞调节，而AKT1的氧化修饰可导致突触功能障碍，导致AD患者产生认知功能障碍[27]。MAPK可传导细胞膜受体信号到细胞核，参与调节神经元增殖、凋亡等，其与学习记忆能力联系紧密，可调控与AD密切相关的病理机制如神经毒性、神经炎症和突触功能障碍等[28]。因此，以上靶点可能在沙棘治疗AD中发挥重要作用。

GO富集分析结果显示，从分子功能富集结果来看，沙棘治疗AD主要体现为激活转录因子结合；从细胞组成富集结果来看，沙棘治疗AD主要体现在小窝；从生物过程富集结果来看，沙棘治疗AD主要体现为细胞对活性氧的反应、核受体活性、脂多糖介导的信号通路。这提示沙棘治疗AD呈现多成分、多靶点、多途径的作用特点。

KEGG代谢通路富集结果显示，沙棘治疗AD涉及的信号通路包括TLRs信号通路、IL-17信号转导途径、神经营养蛋白信号通路等。TLRs是天然免疫受体，TLRs家族中的TLR4信号转导通路可通过髓样分化因子88的激活和相应的下游效应因子，使核因子κB(NF-κB）的抑制因子IκB磷酸化，从而活化NF-κB，启动相应的基因转录[29]。NF-κB是最重要的转录因子之一，具有多向性转录激活功能，可参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡等多种生理病理过程[30]。神经营养蛋白家族可通过Trk酪氨酸激酶受体结合发挥作用。神经营养蛋白/Trk信号通路通过连接多种细胞内信号转导调节，对于神经发育、学习记忆起着重要作用[31]。因此，推测沙棘活性成分可通过抑制TLRs家族中TLR4信号的转导，减少NF-κB信号通路下游的炎性因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）等的分泌；同时还可抑制IL-17信号转导途径，降低IL-17含量；激活神经营养蛋白信号通路，增加神经营养蛋白因子含量，发挥抗AD作用。结合分子对接和KEGG代谢通路富集分析结果发现，沙棘治疗AD是通过炎症相关通路及炎症因子发挥着重要作用，因此后续需通过体内药理实验对炎症相关通路进行验证。

本研究通过动物实验发现，沙棘提取物对AlCl3联合D-gal所致AD模型小鼠有积极影响：在水迷宫试验中，沙棘提取物能够使模型小鼠的逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，提高其学习记忆能力；组织病理学观察结果显示，沙棘提取物能使模型小鼠的脑海马体组织损伤减轻；机制研究显示，沙棘提取物能够降低模型小鼠脑海马体组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量，该结果与网络药理学分析结果一致。

综上所述，本研究初步预测了沙棘治疗AD的活性成分、靶点以及信号通路，其中活性成分可调控多个靶点，关键靶点同时参与多个重要信号通路的调控，体现出沙棘多靶点、多通路协同作用的特点；同时，通过动物实验初步验证了沙棘可通过抑制炎症因子的表达，来减轻AD模型小鼠海马体损伤，改善小鼠学习记忆能力。本课题组将以此结果为理论基础，对沙棘的活性成分及治疗AD的药理机制进行深入研究，为沙棘治疗AD机制的进一步研究及其相关产品的开发提供依据。

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基金:国家自然科学基金青年科学基金资助项目(No.8160-3282);中国博士后科学基金面上资助项目(No.2015M571454);中央支持地方高校改革发展基金(No.2019zyzcdf-01);黑龙江省自然科学基金青年科学基金资助项目(No.QC2018119);黑龙江省博士后资助项目(No.LBH-Z14204);黑龙江省北药与功能食品“双一流”特色学科建设项目(No.黑教联〔2018〕4号);黑龙江省教育厅基本科研业务费基础研究项目(2017-KYYWF-0585);佳木斯大学优秀学科团队项目(No.JDXKTD-2019005).