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果王素抗大鼠肺纤维化的作用

2024-02-18 41 上传者：管理员

摘要：目的通过观察不同剂量的果王素对肺纤维化大鼠肺组织中成纤维细胞生长因子2(FGF2)及细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)的影响。方法 SD大鼠分为空白对照组(0.9%NaCl),模型组(0.9%NaCl),阳性对照组(5 mg·kg-1醋酸泼尼松),低、中、高剂量实验组(60、120、180 mg·kg-1果王素),除空白对照组气管内一次性注入0.9%NaCl外，其余各组气管内一次性注入5 mg·kg-1博来霉素A5构建大鼠肺纤维化模型。用蛋白质印迹法、实时荧光定量聚合酶链反应检测FGF2、ERK1/2蛋白及mRNA的表达情况。结果空白对照、模型组、阳性对照组和高、中、低剂量实验组的FGF2蛋白相对表达水平在第28天时分别为0.07±0.01、0.63±0.15、0.14±0.02、0.16±0.01、0.26±0.02和0.44±0.03,ERK1/2蛋白相对表达水平在第28天时分别为0.06±0.00、0.41±0.05、0.09±0.00、0.10±0.00、0.14±0.02和0.21±0.02,FGF2 mRNA相对表达水平在第28天时分别为0.98±0.05、9.32±1.03、2.21±0.32、2.87±0.44、5.32±0.21和6.37±0.66,ERK1/2 mRNA在第28天相对表达水平分别为1.00±0.01、9.22±0.85、1.93±0.63、2.36±0.54、5.34±0.44和6.85±1.09。模型组的上述指标与空白对照组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);阳性对照组和低、中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论果王素可能通过调控FGF2和ERK1/2的表达抑制肺纤维化。

关键词：
IPF
成纤维细胞生长因子2
果王素
细胞外调节蛋白激酶1/2
肺纤维化
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肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)以纤维细胞增生和肺泡间质炎性细胞浸润为主要病理学特征，随着病情的不断发展，将会引起间质性肺纤维化[1]。在继发性肺纤维化中，部分病例无法找到明确病因，并且以普通型间质性肺炎为特征性病理改变，称为特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)。IPF是特发性间质性肺炎中最常见的类型，以往临床多使用糖皮质激素和免疫抑制药，但疗效欠佳，药物不良反应大[2]。成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2, FGF2)和细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signaling-regulated protein kinases1/2, ERK1/2)在肺纤维过程中发挥了重要的调控作用[3]。果王素(Kiwi fruit essence)可降低血脂、减少炎性因子，抑制肿瘤以及抗氧化等作用[4]。本研究旨在探究果王素对大鼠肺纤维化的治疗作用。

一、材料与方法

1 材料

动物雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，鼠龄8周，体质量(210±15)g, 购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0014。本实验经湖南医药学院医学伦理委员会批准[伦理批号：湖医伦审2022(A11003)号]。

药品与试剂果王素(中华猕猴桃果仁非饱和度油脂),规格：每升600 g, 批号：XH20200921,湘西老爹生物有限公司生产；盐酸博来霉素A5,规格：每支15 mg, 批号：16049011,批准文号：国药准字H20055883,浙江海正辉瑞制药有限公司生产；醋酸泼尼松片，规格：每片5 mg, 批号：20200214,批准文号：国药准字H22023546,长春迪瑞制药有限公司生产。HRP标记山羊抗兔、兔抗山羊、山羊抗大鼠抗体，均由美国Jackson公司生产；苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色液、Masson染液套装，均由南京生航生物科技有限公司生产；BCA蛋白定量检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司生产；DAB显色测定试剂盒，北京索莱宝技术有限公司生产。

仪器UV1700紫外分光光度计，日本Pharmaspec ShiMDAzu公司产品；DYY-6C电泳仪，北京六一仪器厂产品；E-Blotter转膜仪，美国WEALTEC公司产品；LV-150显微镜，日本NiKon公司产品；CFX Connect荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)仪、Chemidoc XRS+凝胶成像仪，均为美国Bio-Rad公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[5,6]5-6]

将大鼠给予20 g·L-1戊巴比妥钠45 mg·kg-1腹腔注射麻醉，在腹腔注射麻醉生效后实行常规灭菌、铺巾，在无菌条件下完成颈正中切口，充分暴露气管，从大鼠气管软骨缝隙中缓慢插入，然后缓慢注入5 mg·kg-1博来霉素A5(溶于0.9%NaCl 0.2 mL),而空白对照组在相同条件下注入0.9% NaCl 0.2 mL。操作完毕后，缝合皮肤、消毒，待大鼠清醒后，继续完成常规饲养。

2.2 动物分组与给药方法

随机从128只大鼠中选择8只作为空白对照组，其余120只大鼠随机分为模型组、阳性对照组，低、中、高剂量实验组，每组各24只大鼠，除空白对照组外，其余各组构建大鼠肺纤维化动物模型，而空白对照组在相同条件下注入0.9% NaCl 0.2 mL。于造模第2天起，低、中、高剂量实验组分别给予60、120、180 mg·kg-1果王素，每天灌胃1次；模型组和空白对照组于第2天起每天给予0.9%NaCl 2 mL,灌胃1次；阳性对照组每天给予5 mg·kg-1醋酸泼尼松，溶于0.9%NaCl溶液2 mL,灌胃1次。除空白对照组于28天全部处死，其余各组分别于第7、14、28天各处死8只。

2.3 肺组织病理学检查[7]7]

取大鼠右肺组织石蜡包埋，切片厚度为5 μm, 随后进行 HE、Masson 染色，用Image-Pro Plus 6.0的图像分析软件进行肺泡炎症以及肺组织纤维化程度的评分。

2.4 蛋白质印迹(Western blot)法检测肺组织FGF2、ERK1/2蛋白的表达水平[8]8]

取大鼠左肺组织，加入裂解液，用超声波粉碎机对组织样本进行粉碎，BCA法测蛋白浓度，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，加入一抗，在4 ℃下孵育过夜，二抗，室温下孵育1 h, 用化学发光成像系统进行曝光，观察成像效果，根据Image J图像分析软件分析目标带灰度值。

2.5 实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测肺组织FGF2、ERK1/2 mRNA水平[9]9]

取大鼠肺组织约50 mg, 用TRIzol试剂获取组织总RNA,测定大鼠FGF2、ERK1/2 mRNA的表达水平。PCR反应体系体积为20 μL,扩增程序为预变性95℃ 5 min, 随后进行变性95 ℃ 45 s, 退火58 ℃ 30 s, 延伸72 ℃ 30 s, 共计40个循环，计算2-ΔΔCt值。

3 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以表示，多组间的方差相等时，组间比较用F检验，事后两两组件比较用Tukey法；多组间方差不齐时，组间比较用Welch检验，事后两两组间比较用Games-Howell法。

二、结果

1 各组大鼠肺组织病理学改变

空白对照组给予0.9% NaCl; 模型组给予0.9% NaCl; 阳性对照组给予5 mg·kg-1醋酸泼尼松；低、中、高剂量实验组分别给予60、120、180 mg·kg-1果王素，除空白对照组气管内一次性注入0.9% NaCl外，其余各组一次性气管内注入博来霉素A5构建大鼠肺纤维化模型。

在HE染色中，空白对照组肺泡壁未见明显增厚，肺泡结构清晰可见，肺间质内未见明显炎症细胞浸润，毛细血管扩张不明显。其余各组中第7天炎症最重，间质内毛细血管扩张充血，肺泡间有大量炎症细胞浸润，随着时间推移，炎症细胞逐渐减少，肺泡间隔增宽，肺泡融合。而在Masson染色中，除空白对照组外，其余各组在第7天纤维化程度最轻，第28天纤维化程度最重，蓝染最重，胶原纤维面积最多，肺组织破坏严重。高、中、低剂量实验组和阳性对照组的肺泡炎和纤维化程度评分均显著低于模型组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);而高剂量实验组与阳性对照组间肺泡炎和纤维化程度评分比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),见表1。

2 各组大鼠肺组织FGF2、ERK1/2蛋白相对表达水平的比较

除空白对照组外，其余各组在第14天时肺组织FGF2蛋白相对表达水平最高，随时间推移逐渐减弱，而在第7天时ERK1/2蛋白相对表达水平最高，随后逐渐减弱。在各时间点，模型组FGF2、ERK1/2蛋白相对表达水平最高，高、中、低剂量实验组和阳性对照组FGF2、ERK1/2蛋白相对表达水平均显著低于模型组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);而高剂量实验组与阳性对照组间FGF2和ERK1/2蛋白相对表达水平比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),见表2。

表1 各组大鼠肺泡炎、肺纤维化评分的比较

表2 各组大鼠不同时间点肺组织成纤维细胞生长因子2(FGF2)、细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)蛋白相对表达水平的比较

表3 各组大鼠不同时间点肺组织FGF2、ERK1/2 mRNA表达水平的比较

3 各组大鼠肺组织FGF2、ERK1/2 mRNA表达水平的比较

大鼠肺组织FGF2 mRNA在第14天时表达最高，随时间推移逐步降低，28天时最低。ERK1/2 mRNA在第7天时表达最高，随后逐步降低。空白对照组FGF2、ERK1/2 mRNA表达最低，模型组FGF2、ERK1/2 mRNA表达最高，空白对照组与模型组比较在统计学上有统计学意义(P<0.01);高、中、低剂量实验组和阳性对照组FGF2、ERK1/2 mRNA表达均明显低于模型组，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);而高剂量实验组与阳性对照组间FGF2和ERK1/2 mRNA表达水平比较，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05),见表3。

三、讨论

肺纤维化是多种原因引起的慢性炎症性间质性肺疾病，好发于中老年人群，病死率极高[17],病因复杂，诊断率随着肺部高分辨电子计算机断层扫描的普及有所增加，但具体机制仍未明确。目前，学者普遍认为其发病机制主要有炎性细胞的作用、氧化与抗氧化的平衡破坏、上皮细胞与内皮细胞异常增生以及端粒酶结构异常、内质网应激等[10,11]。

酪氨酸激酶受体的活动与纤维化相关[12],主要受体有成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor, FGFR)、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR)以及血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor, PDGFR)。FGF是一种促进成纤维细胞生长的多肽类物质，能促进成纤维细胞的有丝分裂与中胚层细胞的生长，同时还可促进内皮细胞的游走，平滑肌细胞的增殖，避免平滑肌细胞游走。同时，FGF亦可促进新生血管形成，修复损害的内皮细胞。配体FGFs家族有4个亚家族共22种，第1家族中的FGF2可以通过分泌或直接在细胞中起到作用，并可诱导肺成纤维细胞中的胶原蛋白合成[13]。受体FGFRs有4种，即FGFR1～4,其中，配体FGF2与受体FGFR2有较高的亲和力。

肺纤维形成过程中产生多种致炎因子，在致炎因子的刺激下，使得FGF2和FGFR2在肺组织呈现高表达，而高表达的FGF2又可激活FGF2/FGFR2/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular signaling-regulated protein kinases, ERK)信号通路，参与PF的形成[14],由此可见，FGF2可能是肺纤维发生过程中关键的调节因子。ERK1/2既是细胞增殖与分化信号传导的共同通路，也是成纤维细胞中多种信号向核内传递的共同途径，参与调控细胞的增殖、分化、肿瘤以及纤维化形成[15]。

果王素是从中华猕猴桃果仁中提取，主要作用成分ALA在抗脏器的纤维化中得到证实[16],但其是否通过调控FGF2、ERK1/2因子达到抗肺纤维化的作用尚未得到证实。本研究结果显示，在HE染色中可以看出，高剂量实验组干预7、14、28 d后肺泡炎评分均显著低于模型组和低、中剂量实验组(均P<0.05),且未见肺部的片状坏死，肺组织结构基本正常。而在Masson染色中，高剂量实验组的肺泡结构清晰，纤维化不明显，由此可见果王素能降低大鼠肺炎评分，减轻炎症反应作用，且高剂量果王素效果更佳，表现出剂量依赖性，同时能通过减轻肺部炎症程度达到治疗肺纤维化的目的。在各干预组中，除去空白对照组，其余各干预组中FGF2蛋白相对表达水平及mRNA表达在第14天时最高，随后逐渐降低，而ERK1/2蛋白相对表达水平及mRNA表达在第7天时最高，第14、28天逐渐降低，组内相比，空白对照组FGF2、ERK1/2蛋白及mRNA表达均显著低于其余各干预组(均P<0.05),模型组FGF2、ERK1/2蛋白及mRNA表达均显著高于其余各干预组(均P<0.05),高剂量实验组FGF2、ERK1/2蛋白及mRNA表达均明显低于低、中剂量实验组(均P<0.05),但和阳性对照组相差不大，在统计学上差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究提示，果王素可能通过调控FGF2、ERK1/2蛋白及mRNA抗肺纤维化。

参考文献:

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基金资助:湖南省自然科学基金资助项目(2021JJ40385);湖南省教育厅一般基金资助项目(22C1182);

文章来源:陈荟婷,魏宁宁,董晓军等.果王素抗大鼠肺纤维化的作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(03):393-397.