信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)是一种单链大分子，与细胞核中DNA的遗传序列相对应，由核糖体读取并以细胞周期无关的方式导致进行的蛋白质翻译，降解迅速，不与宿主基因组相互作用[1]。基于mRNA制备mRNA疫苗，其优点：①高效性，mRNA理论上可以满足所有遗传信息的要求来编码和表达各种蛋白质，mRNA在细胞质中表达，并不会进入细胞核，可以更有效地表达靶蛋白；②安全性，具有内在的自佐剂特性，实现强大的体液和细胞免疫反应，并且不会整合到基因组序列中减少了插入突变[2];③成本效益高，体外转录(in vitro transcription, IVT)mRNA疫苗具有高效快速的大规模生产能力，mRNA疫苗生产有可能被标准化。

1、 mRNA疫苗分类和mRNA疫苗结构修饰

mRNA分为自扩增核糖核酸(self-amplifying mRNA,sa-RNA)和非复制mRNA。非复制mRNA与真核细胞中的天然mRNA结构相同，由5′端-帽(five prime cap, 5′-cap)、5′-非翻译区(untranslated region, UTR)、编码疫苗抗原的开放阅读框(open reading frame, ORF)、3′-UTR和多聚腺苷酸尾[poly-adenylated tail, Poly(A)]组成[3]。

基于mRNA完整结构对其来修饰进一步优化mRNA疫苗的效率。5′-cap修饰可以添加m7GpppG结构帽类似物或者使用封端酶/脱帽酶。防止常规帽类似物与mRNA序列反向结合，加入抗反向帽类似物。在3′-UTR中引入稳定元素，在5′-UTR中添加序列时，防止mRNA翻译过程中阅读框的错误启动和替换[4]。此外，基于细胞培养系统选择鉴定新的UTR,用来增加IVT mRNA的蛋白质表达。ORF为mRNA的编码区，使用同义的高频密码子或低频密码子取代ORF中的低频密码子或高频密码子，从而翻译高表达或低表达基因，然而，在ORF中使用低频率的密码子可以产生更高质量的蛋白质产物[1]。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)是Poly(A)必需的，缺乏m6A,mRNA会快速去乙烯化并且降解。Poly(A)序列可以减缓RNA外切酶的降解过程，从而提高mRNA稳定性，延长体内半衰期。通过调整Poly(A)序列长度可以优化mRNA的翻译效率。因此，mRNA修饰5′-cap和ploy(A)增加了mRNA的稳定性，修饰5′-UTR、3′-UTR和ORF调节了mRNA的翻译起始和蛋白质的产生[5]。

2、 mRNA疫苗作用机制

mRNA疫苗发挥作用的基本原理是将编码一种或多种肿瘤相关自身抗原(tumor associated antigens, TAAs)或肿瘤特异性抗原/独特肿瘤抗原(tumor specific antigen, TSA)的转录物通过主要组织相容性复合物呈递到宿主细胞细胞质中，将转录物表达到靶向抗原中，抗原可诱导B细胞介导的体液反应和CD4+T/CD8+细胞毒性T细胞反应，从而有利于有效清除恶性肿瘤细胞[6]。mRNA疫苗除了诱导细胞和体液反应外，还具有内在的自佐剂特性，可以直接激活一些模式识别受体，从而刺激机体产生固有的免疫应答。一些癌症疫苗与免疫系统识别患者之间共享的“肿瘤相关抗原”,而另一些疫苗则专注于每个患者独特的“新抗原”。目前，对于mRNA疫苗研究主要使用生物信息学方法，进行筛选和鉴定肿瘤相关抗原，并选择适用的免疫亚型。然而对于不同癌症的不同患者免疫亚型的新抗原和个性化的mRNA疫苗，还需要进一步研究。

3、 mRNA疫苗对癌症的治疗应用

癌症免疫疗法目的是通过激活宿主抗肿瘤免疫反应，进而改变肿瘤微环境，最终减缓肿瘤的作用并提高患者的生存率[6]。肿瘤抗原由TAAs和TSA 2个主要组分组成。TAAs具有较弱的肿瘤特异性和免疫原性，也在非恶性组织中有一定表达。TSA是源自肿瘤细胞突变的肿瘤新抗原，具有很强的肿瘤特异性和免疫原性，机体耐受性较弱，但TSA在正常细胞中不表达[7]。靶向TAAs或TSA的疫苗可以特异性攻击和破坏过表达抗原的恶性细胞，并通过免疫记忆对不同类型的肿瘤实现慢性治疗反应。癌症免疫疗法虽然进行了较多临床试验，但由于免疫原性肿瘤(冷肿瘤)的细胞只有较低的免疫活力(冷免疫)导致检查点抑制剂低反应率，设想通过癌症疫苗能够将冷肿瘤转为无免疫原性肿瘤(热肿瘤),使得肿瘤细胞表面有足够的抗原，才能有效激活免疫系统。一些癌症早期无明显症状，后期癌症转移和扩散非常迅速。癌症药物开发的传统方法是在晚期疾病中测试新药，而癌症疫苗可能需要在患者具有功能免疫系统的早期疾病中使用。本文设想对早期疾病患者的癌症潜在肿瘤抗原或者新抗原进行更多评估，设计癌症的潜在抗原平台，从而达到mRNA疫苗对于早期疾病患者诊断、预防和治疗的作用。

3.1 乳腺癌

据《2023年癌症统计》[8],仅乳腺癌就占女性癌症的31%,因此研究针对乳腺癌治疗方法尤为重要。通过生物信息学，鉴定出与预后和免疫细胞浸润有关的几种肿瘤相关抗原SLC7A5、CHPF、CCNE1和CENPW,与预后不良相关的IS2肿瘤的乳腺癌患者具有“热”表型是mRNA疫苗接种的合适人群[9]。三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)亚型与其他亚型相比，常规内分泌或靶向药物对TNBC无效，且预后较差。通过配体依赖性辅助抑制因子逆转免疫检查点抑制药(immune checkpoint inhibitors, ICIs)进行治疗TNBC耐药性，摆脱了TNBC的干扰素限制[10]。通过嵌合抗原受体T细胞疗法和双特异性抗体的免疫治疗方法鉴定的人乳腺癌标志物，另外开发计算机管道进行设计新抗原mRNA疫苗，并且通过靶向多种新抗原来设计精确的多表位mRNA疫苗用于乳腺癌治疗。

mRNA疫苗和单克隆抗体的联合免疫疗法效果更好，通过将抗CTLA-4单克隆抗体与mRNA疫苗结合，构建编码肿瘤抗原MUC1/纳米颗粒的mRNA疫苗递送至淋巴结中的树突状细胞(dendritic cells, DCs),DCs成功表达肿瘤抗原并且可以诱导针对TNBC细胞的强烈抗原特异性和T淋巴细胞反应[11]。从临床和工业角度进行设计对TNBC患者单独表达的肿瘤抗原和肿瘤新抗原的个性化mRNA疫苗，此外，启动突变型工程RNA免疫治疗项目(NCT02316457),该项目通过开发计算医学平台，用于识别TNBC患者TAAs和TSA,并建立了一个用于共享肿瘤抗原的mRNA疫苗仓库。

3.2 肺癌

基于免疫特征构建了小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)的新免疫表型，鉴定出NEK2、NOL4、RALYL、SH3GL2和ZIC2为潜在的SCLC mRNA疫苗抗原，并且免疫高的免疫亚型更适合ICIs治疗[12]。通过生物信息学，筛选和鉴定相关免疫标志物，其是研制肺腺癌(lung adenocarcinoma, LUAD)mRNA疫苗的潜在肿瘤特异性抗原，结果表明，低IRS评分患者，肿瘤微环境免疫反应越强，因此更适合用免疫疗法和疫苗[13]。

CV9201和BI1361849(CV9202)是2种在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)进行临床测试的mRNA疫苗[14]。CV9202由鱼精蛋白配制的序列优化mRNA组成，该mRNA编码5种NSCLC相关抗原：MAGE-C1、MAGE-C2、NY-ESO-1、5T4和生存素。CV9202具有与CV9201相同的组成，但添加了黏蛋白-1。CV9202主要用于联合免疫疗法，CV9202联合局部放疗治疗无法手术切除的Ⅲ期NSCLC患者、CV9202联合阿法替尼用于治疗晚期或转移性表皮生长因子受体突变的NSCLC患者、CV9202与靶向PD-L1单抗和靶向CTLA-4单抗联合治疗(NCT03164772),此外NSCLC患者与晚期食管癌症患者进行临床研究(NCT03908671),来研究其治疗效果和针对肺癌的个性化mRNA疫苗。

3.3 胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma, PAAD)

PAAD的生存率非常低，并且对ICIs基本上不敏感。研究发现，在PAAD中，过表达和突变的肿瘤抗原并且是开发抗PAAD mRNA疫苗的有效抗原，包括ADAM9、EFNB2、MET、TMOD3、TPX2和WNT7A,其中冷免疫的免疫亚型的IS4和IS5肿瘤患者适合接种疫苗[15]。BioNTech公司的个性化mRNA疫苗autogene cevumeran(BNT122)是一种系统性核糖核酸-脂蛋白个体化新抗原特异性免疫疗法疫苗，用于刺激可手术切除肿瘤的PAAD患者对新抗原的免疫力。对其实时合成mRNA新抗原疫苗，按顺序给予抗PD-L1抗体，含有多达20种纳米颗粒新抗原的个体化mRNA新抗原疫苗和4种药物化疗方案，结果显示，血液中疫苗诱导的T细胞对疫苗新抗原具有特异性，具有多功能CD8+效应表型[16,17]。

3.4 黑色素瘤

首批被批准用于治疗转移性黑色素瘤患者的药物是CTLA-4抑制药(ipilimumab)和PD-1抑制药(pembrolizumab、nivolumab)。Ⅱb期KEYNOTE-942试验的结果表明，疫苗mRNA-4157/V940联合Keytruda/ICIs是治疗黑色素瘤的潜在辅助疗法。手术后，与仅接受PD-1抑制药治疗的患者相比，接受联合治疗的患者疾病复发风险显著降低了44%[18]。此外，研究表明，联合使用CTLA-4和PD-1抑制药治疗黑色素瘤患者比单独使用两者有更显著的疗效。在Ⅲ/Ⅳ期黑色素瘤(NCT01676779,NCT01302496)的临床研究中，当Ipilimumab与编码TriMi mRNA相结合时，可产生强大的免疫应答反应。

3.5 前列腺癌

单核细胞疫苗、树突细胞疫苗、病毒疫苗、多肽疫苗和DNA/mRNA疫苗是最常用的前列腺癌疫苗。其中，Sipuleucel-T作为一种基于单核细胞的癌症疫苗，是唯一获得美国食品药品监督管理局批准的前列腺癌治疗性疫苗[19],但Sipuleucel-T是一种自体治疗性疫苗，在美国被批准用于无症状或症状轻微的化疗初期去势抵抗转移性前列腺癌；临床应用比较少。pembrolizumab未被特别批准用于前列腺癌治疗，但pembrolizumab和nivolumab联合已获批前列腺癌疗法的临床试验[20]。

4、 mRNA对传染性疾病的预防应用

疫苗是预防、控制和根除传染性疾病的重要工具，也是全球公共卫生计划的基本组成部分。mRNA疫苗通过编码疾病特异性抗原被应用于传染性疾病的预防。美国FDA最近批准了2种预防性疫苗，一种用于导致宫颈癌的人乳头状瘤病毒，另一种用于可导致肝癌的乙型病毒性肝炎病毒[6]。除了已批准的mRNA疫苗外，mRNA疫苗已经在多种传染性疾病中进行诱导抗病毒免疫的临床前和临床试验，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)、人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)、流感病毒等方面。

4.1 SARS-CoV-2

针对冠状病毒疾病批准的2种疫苗是Moderna公司开发的mRNA-1273和BioNTech/辉瑞公司开发的BNT162b2。mRNA-1273显示出良好的抗新型冠状病毒肺炎效果，显著保护个体免受新型冠状病毒肺炎的侵袭。BNT162b2在SARS-CoV-2变种情况和新型冠状病毒肺炎预防有显著的安全性，与接种了mRNA-1273的人相比，接种BNT162b2的人感染率高2%,但症状、住院、入住ICU和死亡率较低。使用循环无细胞DNA动力学来评估在使用BNT162b2后特异性免疫细胞类型的更新情况，结果表明，SARS-CoV-2疫苗在免疫系统反应中具有关键作用[21]。此外，研究结果表明，迫切需要针对感染SARS-CoV-2的癌症患者提出新型免疫策略，特别是患有血液系统癌症和接受抗B细胞疗法癌症的患者，同样需要新型免疫策略来预防老年癌症患者的新型冠状病毒肺炎的侵袭。

4.2 HIV

自身免疫性疾病的特点是由于对自身抗体的免疫反应失调而引起的慢性炎症。目前仍没有有效预防HIV的mRNA疫苗，主要是因为HIV包膜的蛋白质具有显著的抗原性多样性，并且病毒致密的糖链保护层隐藏了关键包膜蛋白的表位。实验设计同时表达膜锚定的HIV-1包膜蛋白和猴免疫缺陷病毒Gag蛋白的mRNA疫苗，诱导机体产生中和抗体和CD4+T细胞反应。含有BG505 MD39.3变体的疫苗，通过引导前体B细胞的亲和力成熟来增强特异性抗体产生[22]。此外，临床试验IAVIG002评估eOD-GT8纳米颗粒用于种系靶向的安全性和有效性。mRNA疫苗对HIV的开发方面仍处于初级阶段，需要更多的研究来优化这一治疗策略，以实现持久的免疫反应。研究的重点是通过蛋白锚定帮助机体重新激活HIV储存库，从而进行机体的免疫系统作用，并最终提高mRNA疫苗对HIV的疗效。

4.3 流感病毒

针对流感病毒效应分子保守位点的单克隆抗体治疗，通常被认为是一种针对病毒的高度特异性和有效的方法[23]。流感病毒mRNA疫苗的典型靶点是病毒表面的糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)。流感病毒的快速变异导致抗原漂移，mRNA疫苗中的HA抗原成分需要每年进行审查和修改。此外，使用未经修饰mRNA、脂质基纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNPs)包裹、编码全长HA或全长神经氨酸酶(neuraminidase, NA)制成HA/NA mRNA-LNP制剂，无论是作为单价疫苗还是多价疫苗接种，都证明了其在非人类灵长类动物中能够诱导强大的功能性抗体和细胞免疫反应的能力。

在甲型流感病毒和乙型流感病毒方面，通过实验选择流感病毒靶抗原，进一步建立mRNA-LNPs疫苗平台。通过单价或多价的方式，研究结果表明，mRNA疫苗单价时抗体保护作用不完全，可以诱导多价的抗体来提供更全面的保护作用。目前，针对流感病毒的疫苗在临床试验阶段，生产速度快的mRNA疫苗可能成为对抗流感病毒的关键治疗方法。通过试验mRNA流感疫苗再注射宿主体内并被细胞吸收后，会在细胞内表达HA,能够产生针对所有20种流感病毒亚型的血凝素[24]。本文预测mRNA疫苗对于传染性疾病患者能够提供广泛保护作用，显著减少疾病迹象并避免死亡，有望成为预防未来流感大流行的通用措施。

5、 mRNA疫苗递送系统

mRNA疫苗技术快速发展，离不开对mRNA不稳定性和递送系统的研究。目前的mRNA递送系统类型包括直接注射裸mRNA、DCs输送系统的体外装载、LNPs和聚合物纳米颗粒。其中LNPs是最常用的递送系统类型之一。

直接注射裸mRNA是将裸露的mRNA分子直接注射到细胞或组织中，如皮内注射和肌内注射。DCs是免疫系统中最强大的抗原呈递细胞。DCs输送系统通过DCs内化和蛋白水解性处理抗原，将抗原呈递给B细胞和CD8+/CD4+T细胞，启动适应性免疫反应[25]。大多数病毒负载DCs的mRNA疫苗主要用于治疗癌症，如黑色素瘤、非小细胞肺癌和前列腺癌等。

纳米技术在mRNA疫苗的发展为人类癌症的早期诊断和治疗提供了新的策略和前景。通过工程操作，可以有效地将mRNA包裹到LNPs中，防止mRNA被核糖核酸酶降解，并促进细胞内化和内体逃逸。聚β-氨基酯和核酸组成的合成纳米颗粒载体用于全身性递送至肺部，并且在整个肺部实现mRNA的高转染[26]。脂质纳米颗粒、脂质/鱼精蛋白/mRNA纳米颗粒和细胞穿透肽等递送系统已用于配制mRNA疫苗，能够确保mRNA疫苗稳定性并且递送相应的靶位点，最终触发适应性和先天免疫反应。

6、讨论

本文从mRNA疫苗的分类、mRNA疫苗结构修饰、mRNA作用机制、mRNA疫苗在癌症和传

染性疾病方面以及mRNA疫苗的递送系统方面进行阐述，描述了mRNA疫苗在癌症中的肿瘤相关抗原和癌症患者适用的免疫亚型、个性化疫苗对于肿瘤前期诊断和后期治疗具有重要意义，并且对SARS-CoV-2、HIV和流感病毒中的mRNA疫苗临床试验和开发进展方面进行总结mRNA疫苗将成为传染性疾病预防的通用措施。尽管人们对mRNA疫苗治疗癌症和预防传染性疾病方面寄予厚望，但到目前为止，只有少数mRNA疫苗被批准于疾病预防与治疗，mRNA疫苗仍需要更深入的研究。随着新兴的mRNA技术的发展，通过对mRNA稳定性和递送方式进一步改进，同时建立特定个性化mRNA疫苗以及普通抗原mRNA疫苗，本文设想mRNA疫苗在未来可以治疗和预防疾病，并且mRNA疫苗可以极大地扩展到生物医学相关领域方面进行应用。

参考文献:

[5] 周正杰,李鑫.信使RNA药物修饰及其递送系统研究进展[J].浙江大学学报(医学版),2023,52(4):439—450.

[20] 靳通通,周川,赵磊,等.前列腺癌免疫治疗中癌症疫苗的研究进展[J].中南大学学报(医学版),2023,48(1):148—156.

基金资助:佳木斯大学博士专项科研基金资助项目(JMSUZ2019-02);

文章来源:李灿,刘爽,张雪.mRNA疫苗在癌症和传染性疾病方面的研究现状[J].中国临床药理学杂志,2024,40(11):1665-1669.