阿帕替尼是一种新型小分子酪氨酸激酶抑制剂[1]，目前已广泛应用于肺癌、食管癌、胃癌等多种癌症的治疗[2,3,4]。阿帕替尼在体内主要通过细胞色素P450(cyto‐chrome P450,CYP）酶代谢[5]，与其他药物联合使用易导致患者血药浓度发生波动，且不同患者的给药剂量差异较大、不良反应较多，因此有必要对其进行血药浓度监测，进而指导临床进行个体化用药[6,7,8]。本研究采用超高效液相色谱（ultra-high performance liquid chromatography,UPLC）法建立了测定阿帕替尼血药浓度的方法，并结合临床病例分析阿帕替尼血药浓度与患者年龄、给药剂量、不良反应及联合用药之间的相关性，以期为提高阿帕替尼的合理用药水平提供参考。

1、材料

甲磺酸阿帕替尼对照品（纯度96.2%，批号101253-201101）购自中国食品药品检定研究院；甲磺酸阿帕替尼片（商品名艾坦，规格0.25 g/片）购自江苏恒瑞医药股份有限公司。

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱、ACQUITY UPLC仪均购自美国Waters公司；ME55型十万分之一分析天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；TD4A型低速离心机购自长沙英泰仪器有限公司；XW-80A型涡旋混合器购自上海医大仪器有限公司；FTSY96型酶标仪购自山东风途物联网科技有限公司；DK-8D型电热恒温水槽购自上海一恒科技有限公司。

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α）、肾损伤分子1(kidney injury molecule 1,KIM-1）、胱抑素C(cystatin C,Cys C）、白细胞介素18(interleukin-18,IL-18）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（批号分别为KS10208、KS12070、KS13826、KS10711）均购自上海科顺生物科技有限公司。

2、方法与结果

2.1 阿帕替尼UPLC检测方法的建立

2.1.1 色谱条件

以ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7μm）为色谱柱，以乙腈（A)-0.1%甲酸水溶液（C）为流动相进行梯度洗脱（0～10 min,10%A→97%A;10～12 min,97%A→10%A;12～15 min,10%A）；流速为0.2m L/min；柱温为40℃；进样量为5μL；检测波长为254、260 nm。

2.1.2 阿帕替尼标准溶液的制备

精密称取甲磺酸阿帕替尼对照品10.00 mg，用甲醇溶解后定容至100 m L，即得质量浓度为100μg/m L的阿帕替尼标准溶液。

2.1.3 患者全血样本前处理

取一次性真空采血管（12 mm×100 mm，内含惰性分离胶和促凝剂），分别在患者服药前和服药4 h后采集静脉血5 m L，以3 000 r/min离心8 min后取上清液即得空白血清和含药血清，于-30℃冷冻保存，备用。

2.1.4 血清样本预处理

取患者血清样本100μL至1.5 m L离心管中，加入800μL乙腈，涡旋混合3 min，以13 000 r/min离心10 min，取上清液1.2 m L，氮气吹干后用150μL 50%甲醇复溶，充分涡旋1 min，再以13 000 r/min离心10 min，取上清液100μL进样测定。

2.1.5 方法学考察

(1）标准曲线的建立。

将“2.1.2”项下阿帕替尼标准溶液用甲醇进行梯度稀释，制成质量浓度为2 000、1 500、1 000、500、200、100 ng/m L的标准曲线工作液。分别取上述6种质量浓度的工作液20μL，加180μL空白血清（患者接受治疗前采集的血清），混匀制成阿帕替尼血清样本。按照“2.1.4”项下方法进行预处理后，再按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y=61.308X+1 444.2(R 2=0.999 5），表明阿帕替尼检测质量浓度在500～2 000ng/m L范围内线性关系良好。

(2）精密度试验。

取“2.1.2”项下阿帕替尼标准溶液，加入空白血清，配制成阿帕替尼质量浓度为2 000ng/m L的含药血清，按照“2.1.4”项下方法进行预处理后，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，连续进样6次，记录峰面积并计算RSD。结果显示，6次进样峰面积的RSD为3.7%(n=6），表明该仪器的精密度良好。

(3）稳定性试验。

取“2.1.2”项下阿帕替尼标准溶液6份，分别加入空白血清，配制成阿帕替尼质量浓度为2 000 ng/m L的含药血清6份，在4℃条件下分别放置0、2、4、6、12、24 h，按“2.1.4”项下方法对样本进行预处理，再按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，记录峰面积并计算RSD。结果显示，峰面积的RSD为4.9%(n=6），表明阿帕替尼含药血清的稳定性良好。

(4）加样回收率试验。

取“2.1.2”项下阿帕替尼标准溶液，加入空白血清，配制成阿帕替尼质量浓度为450、750、1 000 ng/m L的含药血清，每种浓度平行配制3份，按“2.1.4”项下方法进行预处理，再按“2.1.1”项下色谱条件进样测定并计算样本的加样回收率。结果显示，样本平均加样回收率为96.0%,RSD为2.1%(n=9），表明该方法具有良好的准确度。

2.2 临床应用

2.2.1 研究对象

以安徽中医药大学第一附属医院2022年9月至2023年12月服用过阿帕替尼的癌症患者为研究对象，收集患者全血样本、基本资料、生化检查结果、用药情况等进行回顾性分析。患者的纳入标准包括：（1）年龄>18岁；（2）诊断为癌症；（3）原患疾病为肿瘤；（4）自愿进行阿帕替尼血药浓度监测；（5）阿帕替尼血药浓度已达稳态。患者的排除标准包括：（1）入院时间少于3 d;(2）对阿帕替尼过敏；（3）无法收集肿瘤标志物及血常规检查结果；（4）妊娠期、哺乳期患者。本研究通过安徽中医药大学第一附属医院伦理委员会审查，伦理审查号：2022XJS-MZYY05。本研究为回顾性研究，患者均豁免知情同意。

最终，本研究共纳入了26例患者为研究对象，其中男性18例，女性8例；患者年龄32～82岁；服用阿帕替尼剂量为0.25 g(16例）或0.125 g(10例），均为餐后服药。不同癌症类型患者的治疗方案各异，具体如下——胆囊癌患者（1例）：替雷利珠单抗+阿帕替尼+替吉奥；贲门癌患者（2例）：单用阿帕替尼，或替吉奥+阿帕替尼；胃癌患者（11例）：单用阿帕替尼，或替吉奥+信迪利单抗+阿帕替尼，或信迪利单抗+阿帕替尼，或紫杉醇+替吉奥+阿帕替尼，或奥沙利铂+阿帕替尼，或信迪利单抗+阿帕替尼+卡培他滨；宫颈癌、十二指肠癌、胆管癌患者（各1例）：均单用阿帕替尼；肝癌患者（4例）：替雷利珠单抗+阿帕替尼+奥沙利铂，或卡瑞丽珠单抗+阿帕替尼；肺癌患者（2例）：单用阿帕替尼，或阿帕替尼+依托泊苷；食管癌患者（3例）：白蛋白紫杉醇+阿帕替尼，或阿帕替尼+派安普利单抗+卡培他滨，或伊立替康+替吉奥+阿帕替尼+信迪利单抗。

2.2.2 患者血药浓度监测结果

参考“2.1”项下方法进行样本处理及测定，监测26例患者的阿帕替尼血药浓度。结果显示，阿帕替尼血药浓度在不同患者中的差异较大，测得的最低浓度为103ng/m L，最高浓度为1 932 ng/m L。其中，血药浓度<500ng/m L的患者有6例，500～<1 000 ng/m L的患者有2例，1 000～<1 500 ng/m L的患者有10例，1 500～2 000ng/m L的患者有8例。部分患者血药浓度监测结果色谱图见图1。

图1 部分患者的血药浓度监测色谱图

2.3 阿帕替尼血药浓度与年龄、给药剂量、不良反应及联合用药的相关性分析

2.3.1 阿帕替尼血药浓度与年龄的相关性

采用Graph Pad Prism软件对26例癌症患者的血药浓度分布与年龄的相关性进行分析并作图，结果显示，30～39岁年龄段患者的血药浓度最高，随着年龄的增加血药浓度呈波动下降的趋势。结果见图2。

图2 阿帕替尼血药浓度与年龄的相关性

2.3.2 阿帕替尼血药浓度与给药剂量的相关性

给药剂量为0.125 g时，血药浓度为1 000～<1 500ng/m L的患者有4例，1 500～<2 000 ng/m L的患者有2例，<500 ng/m L的患者有3例，而500～<1 000 ng/m L的患者有1例；给药剂量为0.25 g时，血药浓度为1 500～<2 000、1 000～<1 500 ng/m L的患者各有6例，<500 ng/m L的患者有3例，500～1 000 ng/m L的患者有1例。在0.125 g或0.25 g给药剂量下，阿帕替尼血药浓度在1 000～<1 500 ng/m L范围内的患者最多。

2.3.3 阿帕替尼血药浓度与不良反应的相关性

阿帕替尼临床应用中主要出现的不良反应包括高血压、蛋白尿、出血等[9]。本研究纳入的26例癌症患者，治疗前均未合并有高血压，但合并有蛋白尿4例、尿隐血9例；使用阿帕替尼后，有13例发生不良反应，包括高血压5例、蛋白尿6例、尿隐血10例。其中，血药浓度<500 ng/m L者发生高血压3例、蛋白尿1例、尿隐血1例，血药浓度1 000～<1 500 ng/m L者发生高血压2例、蛋白尿2例、尿隐血5例，血药浓度1 500～<2 000 ng/m L者发生蛋白尿3例、尿隐血4例，血药浓度500～<1 000ng/m L者未见不良反应发生。

2.3.4 阿帕替尼血药浓度与联合用药的相关性

26例癌症患者中，有20例患者采用联合用药方案，其中有4例患者的血药浓度<500 ng/m L,1例患者的血药浓度在500～<1 000 ng/m L范围内，8例患者的血药浓度在1 000～<1 500 ng/m L范围内，7例患者的血药浓度在1 500～2 000 ng/m L范围内。

2.4 肾损伤因子检测

由于蛋白尿和尿隐血与急性肾损伤密切相关[10]，推测服用阿帕替尼可能导致一定程度的急性肾损伤，因此本研究进一步检测了患者治疗前后血清肾损伤因子TNF-α、KIM-1、Cys C、IL-18水平。

采用ELISA法，按试剂盒要求进行操作：从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条，取不同浓度标准品溶液50μL加至标准品孔中；依次将待测样本10μL及样本稀释液40μL加至样本孔中；除空白孔外，标准品孔及样本孔中各加100μL辣根过氧化物酶标记的抗体，恒温箱孵育60 min；弃去液体静置1 min，每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50μL,15 min后在450 nm波长处检测光密度值。采用Excel工作表绘制出标准品曲线，根据曲线方程（y=343.65x-46.309,R 2=0.989）计算样本中肾损伤因子的水平，其中y为光密度值，x为标准品浓度。

ELISA检测结果（图3）显示，患者治疗后血清TNF-α、KIM-1、Cys C、IL-18水平均显著高于治疗前（P<0.05），提示阿帕替尼可能导致一定程度的急性肾损伤。

3、讨论

阿帕替尼是全球第一个治疗晚期胃癌的靶向抗血管生成小分子药物[11]，其能高选择性地竞争细胞内血管内皮细胞生长因子受体2的腺嘌呤核苷三磷酸结合位点，从而抑制肿瘤组织新血管生成[12]，延长患者的生存期。

肿瘤患者病情复杂，临床使用阿帕替尼时存在不同给药剂量及不同治疗方案，个体化差异明显。本研究对26例癌症患者服用阿帕替尼后的血药浓度进行了监测，结果显示，20例使用联合用药方案的患者血药浓度高低不同，这可能是由于阿帕替尼主要由CYP3A4、CYP3A5代谢，少量由CYP2D6、CYP2C9、CYP2E1代谢，当阿帕替尼与CYP3A4强诱导药或强抑制药联用时，可降低或提高阿帕替尼的血药浓度[13]。这提示，临床使用阿帕替尼时需综合考虑患者的生理情况，与其他药物联用时，需依据药物特性调整给药剂量。

图3 阿帕替尼治疗前后患者肾损伤因子水平检测结果比较

阿帕替尼的常见不良反应为高血压、蛋白尿及出血等，本研究发现，血药浓度为500～<1 000 ng/m L的患者未见不良反应发生，提示在该血药浓度范围内用药较为安全，500～<1 000 ng/m L可能为阿帕替尼血药浓度安全性参考范围，不良反应发生风险升高可能与阿帕替尼血液浓度较高相关。

此外，本研究通过分析病例资料发现，治疗后发生高血压、蛋白尿、尿隐血的患者比例均较治疗前升高。同时，治疗后患者的血清TNF-α、KIM-1、Cys C、IL-18水平均显著高于治疗前，表明阿帕替尼具有导致急性肾损伤的可能性，但其具体机制尚不清楚。年龄与血药浓度的相关性分析显示，总体来讲患者年龄越大，其体内阿帕替尼血药浓度越低，提示患者血药浓度可能受到年龄的影响。不同给药剂量与血药浓度的相关性分析显示，在0.125 g及0.25 g这两种不同给药剂量下，服用阿帕替尼的患者，血药浓度主要在1 000～2 000 ng/m L范围内。药物剂量通常与血药浓度成正比，但个体差异、年龄和体质等因素也会影响血药浓度，因此，临床使用阿帕替尼时需要个体化调整剂量。

综上所述，本研究所建立的UPLC方法能快速检测阿帕替尼血药浓度。为保障患者用药的安全性、减少不良反应发生风险，临床使用阿帕替尼时应综合考虑患者的年龄和药物联用等情况，且应注意监测患者的肾损伤相关指标，防范阿帕替尼可能导致的急性肾损伤。

参考文献:

[6]戚志平,马琳,游广辉. 126例丙戊酸钠血药浓度监测结果分析[J].临床研究,2020,28(3):7-8.

[7]洪丽绵,吴水发,张清泉,等.丙戊酸血药浓度与临床疗效､不良反应的相关性分析[J].海峡药学,2021,33(8):79-82.

[8]江艳,陈川,陶赟,等.某院2022年丙戊酸钠血药浓度监测结果分析[J].中国处方药,2024,22(3):76-78.

[10]张俊丽.珠海市2007-2016年136例肾综合征出血热临床特征分析[D].遵义:遵义医学院,2018.

基金资助:国家自然科学基金项目(No.82074059); 安徽省卫生健康科研重点项目(No.AHWJ2022a013); 安徽省学术和技术带头人后备人选资助项目(No.2022H287); 安徽省高校自然科学研究重点项目(No.2023AH050745); 安徽省卫生健康杰出人才项目(No.ahsjhmypygc20240074);

文章来源:段贤春,薛苏君,祝永福.阿帕替尼血药浓度测定方法的建立及临床应用[J].中国药房,2024,35(12):1500-1504.