首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 临床药学论文 > 双吗啉取代吡啶锌和铜配合物的合成、表征及抗癌活性初步研究

双吗啉取代吡啶锌和铜配合物的合成、表征及抗癌活性初步研究

2024-07-10 46 上传者：管理员

摘要：目的研究双吗啉取代吡啶锌、铜配合物(Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu)的合成，并探讨其抗癌活性。方法以进入临床试验的拮抗剂AMD3100为先导化合物，设计、合成Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu,并以高分辨质谱法对它们进行表征。利用X射线单晶衍射法测定晶体结构，紫外-可见吸收光谱分析配合物与小牛胸腺DNA(CT-DNA)的相互作用，并利用形态学和MTT实验探索配合物对胶质瘤细胞的毒活性。结果 Mor2-Py-Zn的晶体结构属于正交晶系，Pbca空间群，吡啶N、两个吗啉N及两个硝酸根的O原子与Zn2+形成了N3O2五配位的三角双锥构型。Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu均与CT-DNA在溶液中有一定的相互作用。Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu对U87的抑制活性都较弱，而对于U251则能显著抑制其增殖。MTT实验表明，Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu对于U251细胞的IC50分别为18.11μmol/L和14.66μmol/L。结论 Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu均表现出对U251胶质瘤细胞的抑制活性，具有继续深入研究其抗癌机理的价值。

关键词：
DNA相互作用
人胶质瘤细胞
抗癌
晶体结构
铜配合物
锌配合物
加入收藏

自顺铂被发现具有优异的抗癌活性以来，金属配合物作为一类区别于传统的有机小分子药物备受合成化学家和药物化学家的关注。尽管经典的铂类药物如顺铂、卡铂和奥沙利铂等在抗癌领域取得了巨大成就，但毒副作用、耐药性等问题一直成为制约其更广泛应用的瓶颈[1,2]。目前解决上述问题的思路有两种：①深入研究抗癌机理及其毒副作用和耐药性的根源，优化、改进配体结构，实现铂类药物的更新换代；②利用毒性更小、在生命体系中广泛存在的金属离子如Zn、Cu等取代Pt, 开发出具有良好抗癌活性且毒副作用更小的非铂类金属配合物，如锌、铜配合物。基于此，人们制备出了大量结构新颖、活性良好的金属配合物，包括Pt、Ru、Os、Cu、Zn配合物等[3,4,5,6,7,8]。

吗啉环作为含有N、O的六元杂环化合物，是一种具有生物活性分子的亚结构，包括止痛、抗炎、抗氧化、抗菌和抗癌等[9,10,11]。同时，N、O由于富含孤对电子，容易与金属离子形成稳定的配位键。因此，将含吗啉的有机配体与Zn2+、Cu2+结合形成配合物[12,13,14]并研究它们的抗癌活性，也成为一个值得探索的研究方向。本课题拟在吡啶的2,6位对称性地引入两个吗啉环，并与Zn2+、Cu2+形成配合物(图1),研究其对胶质瘤细胞的抗癌活性。

图1 配合物Mor2-Py-Zn与Mor2-Py-Cu的合成路线

1、材料与方法

1.1 仪器与试剂

紫外-可见分光光度计(安捷伦Cary 60),DRX-400核磁共振仪(德国Bruker),LCQ电喷雾质谱仪(ThermoFisher),荧光显微镜(奥林巴斯),酶标仪(Gene Company Limited),细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)等。

2,6-吡啶二甲醇(国药集团化学试剂有限公司),氢溴酸(国药集团化学试剂有限公司),浓硫酸(武汉化学试剂厂),二甲亚砜(Adamas),吗啉(Adamas),Cu(NO3)3·6H2O(Adamas),Zn(NO3)3·6H2O(Adamas),小牛胸腺DNA(Beyotime),四甲基偶氮唑盐(Beyotime)等。

1.2 方法

1.2.1 Mor2-Py的合成

2,6-二溴甲基吡啶的合成参见文献[8]。将0.9g的2,6-二溴甲基吡啶(3.4mmoL)溶于20mL CH3CN,加入K2CO3约1.4g。在85℃下搅拌反应并逐渐加入含吗啉0.6g(6.8mmoL)的30mL CH3CN溶液。滴完后，继续反应14h。冷却至室温，过滤除去K2CO3,减压旋干，得黄色油状粘稠液体。以100mL二氯甲烷溶解后加入适量无水硫酸钠，干燥过夜。抽滤，旋蒸，得淡黄色固体0.8g, 产率85%。通过1H NMR、13C NMR和ESI-MS对该合成物进行鉴定。

1.2.2 Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu的合成

称取175.9mg Mor2-Py(0.63mmoL)溶于25mL无水甲醇后，加入Zn(NO3)3·6H2O(206.5mg, 0.69mmoL)。于50℃下搅拌反应6h后，减压旋蒸至干，得淡黄色Mor2-Py-Zn固体粉末。Mor2-Py-Cu的制备同Mor2-Py-Zn类似，只是将Zn(NO3)3·6H2O改为Cu(NO3)3·6H2O。通过HRMS对两合成物分别进行鉴定。

1.2.3 Mor2-Py-Zn的晶体结构测定

将Mor2-Py-Zn粉末以适量无水甲醇微热溶解，静置挥发结晶。约一周后，析出淡黄色块状晶体。对于Mor2-Py-Cu, 我们反复尝试改变晶体培养条件，都没有得到其单晶。晶体结构数据在东京理化四圆单晶衍射仪上收集。单晶采用Cu Kα射线(λ=0.154178nm)为入射光源，以ω-φ的扫描方式收集衍射点。以用SMART和SAINT程序对数据进行还原和晶胞参数修正，以SHELXTL-2014和经验法进行吸收校正，结构用直接法求解。所有非氢原子均用全矩阵最小二乘法对F2各相异性修正，氢原子的加氢方式为理论加氢。配合物Mor2-Py-Zn的CCDC号为2321997。由上述方法得到配合物Mor2-Py-Zn的主要晶体学数据列于表1。

表1 Mor2-Py-Zn的晶体测试数据和解析精修参数值

1.2.4 Mor2-Py-Cu及Mor2-Py-Zn与DNA的相互作用

通过向含有40μmol/L配合物的缓冲溶液中梯度加入CT-DNA的方法，采用紫外光谱法对比研究了Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu与CT-DNA的相互作用。

1.2.5 Mor2-Py-Cu及Mor2-Py-Zn对U87及U251细胞的增殖抑制

选取U87和U251这两种人脑星形胶质母细胞瘤细胞和人神经胶质细胞瘤细胞作为实验对象。以0μmol/L的Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu为对照组，且以50μmol/L(PBS buffer, 0.03%DMSO)的Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu分别对上述细胞进行了48h孵育，然后通过荧光显微镜在×4、×10和×20放大倍数下观察细胞形态的变化。再以0、2.5、5、10、20、40、50μmol/L的浓度梯度，通过MTT实验充分评估Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu对U87和U251的生物相容性与细胞毒性。细胞存活率计算公式为细胞存活率%=(加药细胞OD/对照细胞OD)×100。

2、结果

2.1 Mor2-Py、Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu的合成

Mor2-Py合成鉴定结果如下：1H NMR(400MHz, CDCl3):δ7.63(t, J=7.6Hz, 1H),7.32(s, 1H),7.31(s, 1H),3.73(t, 8H),3.67(s, 4H),2.52(t, 8H),见图2。13C NMR(100MHz, CDCl3)δ157.7,136.8,121.5,77.3,76.7,67.0,64.8,53.8,见图3。ESI-MS:C15H23N3O2,理论值277.36,实测值[M+H]+:278.1854,见图4。

图2 Mor2-Py的1H NMR图(400MHz, CDCl3)

图3 Mor2-Py的13C NMR图(100MHz, CDCl3)

图4 Mor2-Py的质谱图

Mor2-Py-Zn合成鉴定结果如图5 HRMS:[Mor2-Py-Zn+NO3-+H2O]+,理论值422.1093,实测值422.1190。

图5 Mor2-Py-Zn的高分辨质谱图

Mor2-Py-Cu的制备同Mor2-Py-Zn类似，只是将Zn(NO3)3·6H2O改为Cu(NO3)3·6H2O。Mor2-Py-Cu合成鉴定结果如图6。HRMS:[Mor2-Py-Cu+NO3-+1.5H2O]+,理论值429.1118,实测值429.2404。

图6 Mor2-Py-Cu的质谱图

2.2 Mor2-Py-Zn的晶体结构

晶体结构数据(图7)在东京理化四圆单晶衍射仪上收集。重要的键长和键角参数见表2。

图7 Mor2-Py-Zn的晶体结构

Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu与CT-DNA的相互作用结果，如图8所示，两个配合物的特征吸收峰均在263nm附近，随着CT-DNA的加入，吸收峰位置几乎未发生红移或蓝移，而峰的强度逐渐增加，即发生了增色效应，表明Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu均与CT-DNA发生了一定程度的相互作用，且两者的增色能力非常接近。但具体作用方式是否为嵌插结合、沟槽结合还是静电结合，以及结合能力的评估尚不明确，还需进一步通过其它实验如荧光滴定等来确定。

图8 紫外-可见吸收光谱图

2.4 Mor2-Py-Cu及Mor2-Py-Zn对U87和U251细胞的增殖抑制

U87细胞分别在×4、×10和×20放大倍数下观察，存活数量和形态均未明显改变，表明Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu(图9)对U87细胞的抑制活性都较弱。而对于U251细胞，分别在×4、×10和×20放大倍数下观察，细胞密度大幅减小，细胞活力也显著降低，说明Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu(图10)分别对U251具有较好的增殖抑制活性。

图9 2个配合物对U87细胞的抑制情况

图10 2个配合物对U251细胞的抑制情况

2.5 Mor2-Py-Zn及Mor2-Py-Cu对U87和U251细胞的生物相容性和细胞毒性

48h的MTT结果显示，在0～50μmol/L的浓度范围内，Mor2-Py-Zn及Mor2-Py-Cu对U87细胞的IC50均大于100μmol/L,表明2个配合物对U87细胞的抗癌活性均较差(图11A)。而对于U251细胞，细胞活力随着2个配合物浓度的增加均显著降低(图11B),IC50分别为18.11μmol/L和14.66μmol/L,且只有约8%～15%的细胞存活，表明2个配合物对U251细胞均具有较好的抗癌活性。

图11 U87和U251细胞的细胞活力

3、讨论

本文围绕双吗啉取代吡啶类锌、铜配合物的合成、结构表征和抗癌活性展开了一系列研究。其中Mor2-Py-Zn的晶体结构揭示它属于正交晶系，Pbca空间群，三个N原子(分别来自吡啶环与两个吗啉环)及两个硝酸根的O原子与Zn2+形成了N3O2的五配位构型。反复尝试仍没得到Mor2-Py-Cu的晶体结构，这可能是由于金属材料的导热性太好所造成，晶体的形成受外界干扰越小越容易形成，而金属铜相较金属锌具有更好的导热性能，受外界的干扰大，故极难形成晶体。紫外-可见吸收光谱表明Mor2-Py-Zn和Mor2-Py-Cu与CT-DNA均有一定程度的相互作用能力。更重要的是，细胞孵育实验显示我们所制备的两个过渡金属配合物对人神经胶质细胞瘤细胞U251具有良好的抑制效果。MTT实验表明，Mor2-Py-Zn及Mor2-Py-Cu对U251细胞的IC50分别为18.11μmol/L和14.66μmol/L,且以50μmol/L浓度孵育细胞48h后，只有约8～15%的细胞存活，进一步证实了2个配合物对U251细胞均具有较好的抗癌活性。我们将在后续实验中深入研究其对U251胶质瘤细胞的抗癌机制。

参考文献:

[1]朱阳,程珺洁,刘扬中.铂类抗肿瘤配合物的研究进展[J].药学进展,2020,44(4):243

[3]张劲祥,黄伟国,黄嘉良,等.高共轭性的四苯基卟啉-钌(Ⅱ)联吡啶配合物的合成､光学性质及光动力抗癌活性[J].无机化学学报,2022,38(12):2383

[4]张凯龙,余志坚,邱佳庆,等.小分子钌配合物的药学研究[J].化学通报,2019,82(11):972

[6]候晓晓,秦秀英.铜配合物在抗肿瘤方面的研究进展[J].广东化工,2021,48(9):172

[7]任丽磊,彭晓霞,王树军,等.5-氟尿嘧啶卟啉锰/锌配合物的合成､光电性质及抗癌活性[J].无机化学学报,2019,35(6):965

[8]唐婉毓,何雨慧,张清茹,等.含多吡啶的铜､镍､锌配合物的合成与抗癌活性研究[J].湖北科技学院学报(医学版),2023,37(3):196

[9]陈艳华,侯熙彦,支德福,等.齐墩果酸和熊果酸衍生物的合成､表征及抗癌活性的研究[J].有机化学,2016,36(4):795

[10]刘琴,王晓宇,韦昆,等.烯酰吗啉·福美双超低容量喷雾剂的制备与应用[J].化学试剂,2020,42(12):1409

[11]王润宾,韩天植,李知敏,等.一种含吗啉修饰的多吡啶钯(Ⅱ)配合物的合成､表征与抗金黄色葡萄球菌作用研究[J].人工晶体学报,2023,52(10):1842

[15]莫慧雯,刘雅娴,蔡戴宏,等.5-甲基-2-(2′-吡啶基)苯并咪唑及甘氨酸根铜(Ⅱ)配合物的合成､DNA结合及抗癌活性[J].无机化学学报,2019,35(3):477

基金资助:湖北省教育厅重点项目(D20212802);