众所周知，尿路上皮癌是泌尿系统肿瘤领域中最常见的一种类型，其中最常见的为膀胱癌(90%),其次为输尿管癌等。据估计，2022年中国膀胱癌病人新增病例91 893例，死亡42 973例[1]。有20%～30%的患者首次发现时为肌层浸润性膀胱癌，约有一半的患者治疗后发生进展或转移[2]。铂类为基础的化疗长久以来作为晚期尿路上皮癌患者的一线治疗方案，但生存率较低[3]。随着新型药物的研发，免疫治疗进入人们的视野，成为恶性肿瘤患者新的希望。对于尿路上皮癌患者，免疫检查点抑制剂已被批准为顺铂不耐受患者的一线治疗方案[4]。实际临床应用中免疫治疗对多种肿瘤虽然有效，但其原发耐药性可达35%～44%不等，病人难以完全获益[5]。有研究表明，抗生素在多种实体瘤(如黑色素瘤、非小细胞肺癌等)行免疫疗法的过程中起到负面作用[6,7,8]。目前在尿路上皮癌领域的相关研究较少。本研究旨在回顾性分析本院晚期尿路上皮癌患者行化疗联合免疫治疗过程中应用抗生素对其疗效的影响，现报告如下。

1、对象与方法

1.1对象选取

2020年8月至2022年12月在我院确诊为晚期尿路上皮癌且行化疗联合免疫治疗的患者，所有患者均经病理学确诊为尿路上皮癌，且影像学检查证实存在远处转移，其中男性48例，女性23例。该研究得到我院伦理委员会的审批，批号为：伦科批字[2017]第008号。

1.2纳入与排除标准

纳入标准：(1)通过明确的病理组织学诊断证实为尿路上皮癌且第8版分期为ⅢB-Ⅳ期；(2)治疗过程中行化疗联合免疫治疗，免疫治疗药物符合下列任何1项者：特瑞普利单抗、替雷利珠单抗等；(3)抗生素选择(静脉或口服):β-内酰胺类抗菌药物(青霉素类，头孢菌素类),大环内酯类，喹诺酮类等；(4)临床资料完整：通过医院病例系统查找及电话随访收集完整的疗效及生存随访资料。

排除标准：符合以下情况任一条件者：(1)患者患有除尿路上皮癌外的其他原发恶性肿瘤史；(2)未行免疫治疗；(3)合并免疫系统方面的疾病。

1.3方法

1.3.1收集资料

治疗前1 d,对患者行血常规、生化常规等化验及心电图、胸部X线等检查，充分告知化疗联合免疫治疗过程中的注意事项与风险，并签署各项知情同意书。收集患者年龄、性别、体重指数、既往病史、感染部位、肿瘤类型、转移部位、分期及分级、抗生素使用种类及时间、ECGO体能状态评分、手术治疗情况、治疗方案、免疫相关不良反应(irAEs)等相关影响因素。

1.3.2治疗方案与分组

实验分为应用抗生素(A)组和未应用抗生素(B)组，比较两组患者的临床疗效。应用抗生素(A)组定义为肿瘤患者在化疗联合免疫治疗过程中因泌尿系感染、肺部感染等应用抗生素(包括口服或静脉注射，且使用时间≥3 d)。为了探讨抗生素的应用时间对化疗联合免疫治疗的影响，我们定义了一个新的变量，称为抗生素-频次暴露比(antibiotic-frequency exposure ratio, AFER),即在整个免疫治疗期间的“抗生素暴露总天数/抗生素应用频次”,再对应用抗生素(A)组根据AFER的平均值高低分为LAFER组和HAFER组，再比较两组临床疗效。免疫检查点抑制剂应用国产药物(如特瑞普利单抗3 mg/kg每2周1次、替雷利珠单抗200 mg每3周1次等)。期间监测患者的血常规、生化常规等检验学指标。每2周期后进行疗效评估，评估内容主要包括盆腔MRI或CT。治疗至患者出现病情进展、死亡或不可耐受的毒性。

1.3.3疗效评价

应用CT或MRI评价肿瘤病灶数目及大小，留取初始CT或MRI资料、每2周期治疗结束后均进行1次疗效评价，对于提示有肿瘤进展情况，1个月后复查再次判断。采用实体瘤疗效评价标准(RECIST)1.1版评估，分别为完全缓解(complete response, CR)、部分缓解(partial response, PR)、病情稳定(stable disease, SD)及病情进展(progressive disease, PD)[9]。客观缓解率(objective response rate, ORR)为完全缓解和部分缓解病例数所占总例数百分比；疾病控制率(disease control rate, DCR)为完全缓解+部分缓解+病情稳定病例数所占总例数百分比；无进展生存期(progression-free survival, PFS)为从首次应用该治疗方案开始至疾病进展(PD)或死亡的时间[10]。

研究的主要观察终点为PFS,次要观察终点为ORR及DCR。在本研究结束或随访截止(2023年3月9日)时，对病情未进展患者或死亡患者进行截尾处理。

1.4统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件中Kaplan-Meier法对两组患者数据绘制生存曲线。通过Log-rank检验进行单因素分析，再将P<0.05的所有相关影响因素进行多因素Cox回归分析。应用卡方检验或费舍尔(Fisher)精确检验比较两组患者的基线特征和临床疗效数据。P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1两组患者的基线临床特征比较

两组患者的性别、年龄、吸烟史、ECOG评分、肿瘤发病部位等方面的差异均无统计学意义(P>0.05,表1)。

表1两组晚期尿路上皮癌患者的基线临床特征的比较[n(%)]

2.2两组患者的近期疗效比较

抗生素组(A)34例患者，其中1例CR,2例PR,1例SD,30例PD;非抗生素组(B)37例患者，其中4例PR,2例SD,31例PD。抗生素组与非抗生素组相比，ORR分别为8.82%、10.81%(P>0.999),DCR分别为11.76%、19.35%(P=0.737),疗效整体差异无统计学意义(P>0.05,表2)。

表2两组患者的近期疗效对比

2.3两组患者生存期的比较

截至2023年3月9日，达到PFS事件中抗生素组30例(88.24%),未应用抗生素组31例(83.78%)。应用抗生素组的mPFS为6个月(95% CI:4.92～7.08),与未应用抗生素组的8个月(95% CI:5.67～10.34)相比较短，差异具有统计学意义(P=0.001)。两组患者的PFS生存曲线见图1。

2.4晚期尿路上皮癌患者行化疗联合免疫治疗预后指标的单因素与多因素分析

采用单因素分析发现ECOG评分、抗生素使用情况与患者的PFS具有相关性(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示；应用抗生素是患者PFS(HR=2.11,95% CI:1.17～3.81,P=0.014)的独立影响因素(表3)。

图1两组患者的PFS生存曲线 

表3晚期尿路上皮癌患者预后指标的单因素与多因素分析

2.5抗生素应用时间对晚期尿路上皮癌患者化疗联合免疫治疗的影响的分析

根据抗生素-频次暴露比(AFER)最小值为4 d,最大值为14 d,平均值为7.4 d。根据平均值对A组患者进行分组后绘制生存曲线(图2)表明，LAFER组与HAFER组PFS无统计学差异(P=0.768)。即抗生素的持续应用时间低于1周和超过1周均会影响患者的PFS。

图2抗生素组AFER亚组患者PFS的生存曲线  

2.6抗生素(A)组肿瘤分期对晚期尿路上皮癌患者化疗联合免疫治疗的影响

抗生素组中ⅢB期为20(58.82%)例、ⅣA期为7(20.59%)例、ⅣB期为7(20.59%)例。对该组患者根据肿瘤分期绘制生存曲线(图3)表明，肿瘤分期之间PFS无统计学意义(P=0.301),即应用抗生素时，不同肿瘤分期的PFS均会受到影响。

图3抗生素组肿瘤分期亚组患者PFS的生存曲线  

2.7抗生素(A)组感染原因及药物种类的分析

在所有的应用抗生素患者中，抗生素使用的感染原因最多的为泌尿系感染(55.88%),抗生素使用最多的为β-内酰胺类(64.71%)。结果显示P值分别为0.961和0.972,没有统计学意义，即广谱抗生素的感染原因及药物种类的不同没有差异，均会影响化疗联合免疫治疗的临床疗效(表4)。

表4应用抗生素组抗生素应用原因及种类[n(%)]

3、讨论

目前国内外已经有多种免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)药物获批应用于尿路上皮癌，包括国外度伐利尤单抗(durvalumab)、阿替利珠单抗(atezolizumab)及国产替雷利珠单抗、特瑞普利单抗等[11]。针对众多恶性肿瘤患者由于各种原发及继发耐药不能获益的情况，大多数的研究集中在找出与免疫疗法反应有关的生物标志物上，例如PD-L1[12]、炎症的基因表达特征[13,14]、突变负荷[15]等，但寻找与耐药有关的预测因子也至关重要。

同时为了使应用ICIs治疗的患者实现高度持久反应和长期生存，随着医疗领域的进展，化疗联合免疫治疗、双免治疗等方法应运而生。目前进行了数个多中心、随机、对照临床试验(如KEYNOTE-361和IMvigor130),但结果出现了矛盾。KEYNOTE-361是一项随机、开放标签的3期试验[16],包含了来自21个国家的201个医疗中心患有未经治疗的局部晚期、不可切除或转移性尿路上皮癌的患者，通过对1 010名患者入组并分配接受帕博利珠单抗联合化疗(n=351)、帕博利珠单抗单药治疗(n=307)或单独化疗(n=352)治疗的结果进行分析，在一线铂基化疗中加入帕博利珠单抗并不能显著延长患者的无进展生存期和总生存期，不应广泛应用于晚期尿路上皮癌的治疗。而在IMvigor130研究中，二者尽管风险比相似，但得出了相反的结论。IMvigor130是一项多中心、随机、安慰剂对照3期试验[17],包含了来自35个国家221个地点的患有未经治疗的局部晚期或转移性尿路上皮癌的1 213名患者，通过随机分配接受阿替利珠单抗加铂类化疗(n=451)、阿替利珠单抗单一疗法(n=362),或安慰剂加铂类化疗(n=400)治疗，结果表明阿替利珠单抗联合铂类化疗与单独化疗相比，联合用药组可显著延长转移性尿路上皮癌患者的无进展生存期，且组合的安全性与单个药物观察到的安全性一致。二者出现矛盾的原因尚不清楚，可能与两个研究不同的假设检验、样本量、药物不同等因素有关。现已有多项研究表明抗生素(antibiotic, ATB)暴露会对多种恶性肿瘤的ICIs治疗产生负面影响，降低临床疗效及增加耐药性[18,19,20]。在UC领域，随着ICIs的应用也观察到了类似的结果。多个研究[21,22]结果表明接受ATB治疗和未接受ATB治疗的mUC患者相比无进展生存期(PFS)和总生存期(overall survival, OS)显著缩短。但以上的研究针对的基本多为ATB对UC免疫抑制剂的单药治疗的影响，在联合用药时，结果是否出现不同仍未可知。Cortellini等[23]的一项国际多中心研究评估了ATB暴露在非小细胞肺癌患者行化疗联合免疫治疗的影响，发现其治疗的临床疗效不受ATB的影响，推测化疗联合免疫治疗的疗效相比于ICIs单药治疗，可能对肠道菌群的依赖性较小，化疗和免疫治疗之间的协同作用可能会抵消ATB的负面影响。De Giglio等[24]对化疗联合帕博利珠单抗治疗的101名晚期NSCLC患者基线与间期应用类固醇的疗效进行了回顾性分析，结果显示服用基线类固醇的患者的生存期明显短于不服用类固醇的患者和同时使用类固醇的患者。KEYNOTE-361和IMvigor130研究的结果不同是否也受到抗生素及其他伴随药物的影响?

最近的研究表明，肠道微生物群决定了所谓的“免疫癌症设定值”,包括ICIs刺激免疫系统杀死癌细胞的能力，肠道微生物群对ICIs疗效的整体作用得到进一步证实[25,26]。多种肿瘤免疫疗法的疗效和毒副作用的调节与肠道微生物群密切相关[27,28]。例如，双歧杆菌、嗜黏蛋白阿克曼氏菌与PD-1/PD-L1抑制剂治疗的临床益处显著相关[29]。有学者将对ICIs有反应的癌症患者的粪便微生物群移植(fecal microbiota transplantation, FMT)到ATB治疗的小鼠中，促使ICIs恢复了疗效，而无反应患者相同试验未能起到相应的疗效[30]。基于肠道微生物群组成决定或至少部分影响ICIs的抗癌活性，肠道生态系统可能会随着ATB的应用而被破坏，影响肠道微生物群的丰度，部分时间可达数月至数年，同时细胞毒性T细胞对癌症反应的有效性可能也受到了损害，ATB暴露与ICIs疗效降低相关的机制在生物学上是具有可能性的[31,32]。同时有研究表明在恶性肿瘤患者应用ICIs后，抑制T淋巴细胞招募和功能的MPIF-1/CCL23的基线水平在ATB组群中较高，同时ATB治疗组的IL-8/CXCL8也持续增加[33]。IL-8/CXCL8是一种参与骨髓白细胞迁移和中性粒细胞脱颗粒的趋化因子，它与肿瘤的进展和ICIs的获益减少有关[34,35]。一项研究表明早期应用ATB会降低血浆瓜氨酸的比率，而且低浓度与使用纳武单抗生存率低及难以临床获益有关，考虑到瓜氨酸是肠道细胞功能的有效标志物，这可能意味着瓜氨酸不仅是肠道细胞功能的标志物，也可能反映了ATB诱导的肠道菌群失调，影响了肿瘤免疫调节作用[36]。

既往研究表明，肠道菌群通过药物的代谢、免疫调节和结构改变在化疗过程中发挥着至关重要的作用，可以减少化疗的不良反应，并调节这些药物的抗癌作用[37]。《科学》杂志上发表的两项独立研究表明，抗生素混合物(包括万古霉素、亚胺培南和新霉素)降低了奥沙利铂和顺铂对EL4淋巴瘤、MC38结肠癌和B16黑色素瘤小鼠模型的影响，具体而言是由于ATB暴露扰乱了肠道微生物群，导致DNA损伤和ROS产生水平降低，因此奥沙利铂和顺铂的效果降低了[38,39]。其他也有研究表明，抗生素混合物给药会显著降低5-氟尿嘧啶的抗癌活性[40]。与暴露于顺铂和乳酸菌的小鼠相比，暴露于顺铂和ATB的肺癌小鼠模型的存活率显著较低[41]。因此ATB暴露导致的肠道微生物失衡也可能会降低化疗药物的抗癌作用。本研究通过对在我院行化疗联合免疫治疗的71例晚期尿路上皮癌患者进行回顾性研究分析发现，使用抗生素(A)组相比于未使用抗生素(B)组患者的无进展生存期较短。采取生存分析后，单因素分析中ECOG评分(P =0.004)及抗生素应用情况(P =0.001)与患者的PFS有关，多因素Cox回归分析后抗生素应用为患者PFS(HR=2.11,95%CI:1.17～3.81,P =0.014)的独立影响因素，与PFS较短显著相关。因此，在UC领域中，抗生素可能会对其化疗联合免疫治疗的疗效也产生负面影响。

有人可能会认为，晚期肿瘤患者的合并症可能导致患者频繁使用ATB,因此对结果的影响与ATB暴露引起的肠道菌群失调和机体免疫调节改变无关。然而，当前的一些研究反对这一假设，如一项前瞻性、多中心研究中超过80%的患者在ICIs开始时PS评分为0或1,结果表明pATB治疗或cATB治疗均与PS无关，这表明ATB治疗的提供与患者基线功能状态无关[42]。同时，Routy等[43]通过多变量分析表明，使用ATB与患者的较差的预后独立相关，表明使用ATB确实可能是一个独立因素，ATB治疗的患者可能代表免疫系统衰弱的个体亚群，这些个体既容易受到细菌感染，又对抗癌免疫治疗无效，先天性或后天性免疫缺陷(容易感染细菌和免疫监测不良)可以解释ATB使用与ICIs疗效差之间的相关性，却不是导致ICIs差的原因。例如，在一些临床试验中包含了少量的HIV合并晚期肿瘤(非小细胞肺癌、黑色素瘤、卡波西肉瘤、非小细胞肺癌)的患者，这些接受ICIs治疗的晚期癌症患者的ORR、DCR、和安全性与非HIV合并肿瘤患者的观察结果相当[44]。这也侧面反映了是ATB的应用，而不是患者易感的免疫状态导致了较差的ICIs疗效。

广谱抗生素使用3 d后肠道微生物负荷降低了10倍，丰富度也降低了，ATB停药后1～4个月，粪便样本重新获得了部分但不完全的丰富度，总体微生物组分布也发生了变化[5],因此研究探讨ATB暴露的持续时间对患者治疗的影响也很重要。本研究通过定义新的变量抗生素-频次暴露比(antibiotic-frequency exposure ratio, AFER)的平均值作为患者分层的截止值进行了二次分析，最小值为4 d,最大值为14 d,平均值为7.4 d,而LAFER组与HAFER组无明显统计学差异(P =0.768),即ATB的持续应用时间低于1周和超过1周均会影响患者的PFS。这也反映出ATB的使用对于GM的影响是迅速的，提醒我们ATB使用时间的长短均有可能会影响化疗联合免疫治疗的疗效。同时我们的研究中ATB应用多为广谱抗生素，且通过分析表明，广谱抗生素种类的不同没有差异，均会影响化疗联合免疫治疗的临床疗效。这与Mohiuddin等[6]在黑色素瘤免疫治疗的研究结果类似，该研究观察到青霉素类、头孢菌素类和氟喹诺酮类药物均与肿瘤患者的OS较差相关。有学者提出应用ATB途径的不同对ICIs的影响也不同，Mielgo-Rubio等[45]的研究显示虽然抗生素影响了患者的OS与PFS,但是静脉注射ATB的患者比口服ATB患者的OS更短2.9月(95%CI:1.6～4.1)vs 14.2月(95%CI:7.9～20.6)及PFS较短2.2月(95%CI:0.6～3.7)vs 5.9月(95%CI:3.9～8)。本研究中口服抗生素患者较少，难以进行进一步的亚组分析。目前ATB应用途径相关的研究也相对较少，应进一步探讨相关的机制明确疗效，在临床工作中面临艰难抉择时可以帮助医师选择对患者伤害较小的方案，如口服抗生素或选择窄谱抗生素。

综上所述，在化疗联合免疫疗法治疗晚期尿路上皮癌患者时应用ATB会产生不利影响。因此，在肿瘤患者治疗过程中，需综合患者个体化病情情况慎重给予抗菌药物治疗。同时，似乎也有理由进行更多研究来探索其潜在机制，以帮助患者实现最大化临床获益。本研究存在的不足为单中心回顾性研究，病例数量较少，该研究需要在更大的前瞻性的队列研究进行进一步的验证。这项研究也不包括可能额外影响肠道微生物群的食物或食物补充剂的数据，而且我们无法收集粪便样本以进一步分析微生物群。同时尿液微生物群与肠道微生物群很类似，是否参与免疫疗法中我们还不得而知，也是我们未来需要进一步研究的方向。

参考文献:

[9]丁婕,戴旭,孟宪运,等.实体瘤疗效评价标准的研究进展[J].中国肿瘤临床与康复,2015,22(9):1150-1152.

[10]张贺龙.实体瘤疗效评价标准及演变[J].现代肿瘤医学,2010,18(5):839-841.

基金资助:国家自然科学基金青年基金项目(NO:81702495);

文章来源:吕正钦,赵宇豪,Mebinone M.Adeyemi,等.抗生素对晚期尿路上皮癌化疗联合免疫治疗疗效的影响[J].遵义医科大学学报,2024,47(03):246-253+261.