肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)约占成人肾细胞癌的70%～80%,是泌尿系统中常见的恶性肿瘤之一[1]。由于放化疗的耐药性，目前外科手术治疗仍是局限性肾癌的首选治疗手段，但由于肾部分切除的局限性，ccRCC患者术后出现复发转移率高达1/3,且新确诊患者中约30%已经出现远处转移，导致ccRCC患者预后相对较差[2,3]。肿瘤免疫浸润是指具有抗肿瘤作用的异质性免疫细胞在肿瘤组织中的聚焦，在免疫系统中，动态 的细 胞异质性对于抵御各种病原体的攻击至关重要[4]。高度的免疫和血管浸润是ccRCC的特征之一，传统的使用针对已知免疫细胞成分的抗体面板对整个肿瘤的免疫细胞异质性进行分析，不仅无法识别新的免疫细胞亚群，且无法在单个细胞水平上探究瘤内异质性。得益于单细胞RNA测序(single-cell RNA sequencing, scRNA-seq)技术的不断发展，使得在单个细胞水平上揭示瘤内异质性成为可能，为深入探究ccRCC的发病机制、临床诊断及药物的开发提供新思路。

1、单细胞RNA测序技术概述

单细胞RNA测序由TANG等人[5]于2009首次报道，它是一种可以在单个细胞水平上对转录组进行精确全面分析的技术。传统的RNA测序技术体现的是混合细胞的平均基因表达水平，导致数量上处于劣势细胞的遗产信息(通常<1%)被掩盖，无法充分认识细胞间的异质性。与传统的RNA分析技术截然不同，单细胞RNA测序技术不但可以消除这种细胞间的偏倚，而且因其高度的灵敏性还可以对稀缺样本进行分析。此外，单细胞RNA测序提供了整个转录组的测序信息，因此可以用来发现新基因和表面标记物[6],对寻找稀有细胞及未知细胞具有极大的优势。目前该技术已被应用于多个邻域包括肿瘤、神经系统疾病和自身免疫性疾病等[7]。接下来，我们将对单细胞测序技术的流程及方法进行简要介绍。

1.1 单细胞的捕获

单细胞测序的第一步是单细胞的分离。在获得器官或肿瘤组织后首先通过机械粉碎/酶解获得单细胞悬液，然后通过梯度稀释、显微操作、微流控微滴捕获等从单细胞悬液中提取单个细胞[8]。但由于某些RNA分子极其不稳定，需要仔细收集单个“无伤”细胞，传统的捕获技术耗时耗力且成本相对较高。直到2020年Slide-seqV2技术的出现，不仅大大提高了捕获效率，且具有高转录组映射的空间分辨率[9]。随着单细胞RNA测序技术的不断发展，商业化的单细胞测序技术已将细胞分离、溶解、标记建库集于一体。得益于这些新技术，目前单细胞测序费用已不断降低[10]。

1.2 单细胞的测序

在单细胞被成功捕获后，便会对其进行裂解，使胞内RNA与缓冲液、酶、DNTP和引物充分混合，以便进行mRNA反转录为cDNA。目前，主要的反转录策略包括加Poly(A)尾和模板转换。由于单个细胞内含有的RNA总 量约为10 pg, 远低于传统基因测量或分析所需要的纳克量，因此反转录后需要对其进行扩增，由于部分扩增手段存在扩增偏倚，常常会导致测量偏差及测序错误，目前线性扩增方法已被广泛应用，可降低扩增偏倚，代表方案包括CEL-seq、MARS-seq及inDrops。另外，由于在单细胞分离过程中，难免会存在细胞破裂导致RNA流入缓存液中，造成环境污染，影响后续的数据分析。VIEIRA BRAGA等人[11]利用SoupX[12]根据每个条形码的UMI数量，从空液滴中识别环境RNA图谱，不但可以估计环境污染，还提供了一种校正单个细胞表达的方法。扩增后得到的产物进行上机测序。

1.3 数据分析

单细胞测序数据的庞大且复杂给数据分析带来巨大的挑战，短时间内单细胞测序数据分析方法激增[13]。但分析流程大同小异，主要包括数据的预处理、矫正、降维与表征、聚类、差异表达与功能富集、网络构建等[14]。正如前面我们所提到的测序过程中难以避免的“噪声”,因此数据分析之前的质量控制显得尤为重要。目前常用的质量控制指标包括线粒体reads、热休克蛋白和核糖体蛋白等。为了能够实现跨细胞基因表达比较，需要排除测序的读取数或每个细胞识别的转录本数而产生的技术差异，通常会对预处理后的数据进行标准化[15,16,17]。由于细胞内基因表达丰度不均，且为了将高维数据简化便于分析且保留原始数据的关键特征，会对其进行降维处理，目前t分布随机邻域嵌入算法(t-distributed stochastic neighbor embedding, t-SNE)、主成分分析(principal component analysis, PCA)已被广泛应用于降维处理[18]。后续的分析通常根据研究人员针对不同的研究目标，选择不同的分析策略。

2、单细胞RNA测序与ccRCC的研究

由于ccRCC的瘤内复杂的细胞组成和高度的异质性，因此，传统的高通量测序无法对瘤内单个细胞进行精准分析和细胞分型，忽视了细胞间的差异，单细胞测序在单个细胞水平上描述瘤内异质性，已经成为研究瘤内异质性和鉴别细胞类型的重要手段，有望为ccRCC的治疗策略提供新思路。

2.1 ccRCC的起源

肾脏由形态和功能不同的细胞类型组成，哺乳动物肾脏至少有16种高度分化的上皮细胞类型，而内皮细胞、间质细胞、免疫细胞等类型则可能更多[19],这种复杂的混合细胞组成为探索ccRCC的发生发展带来巨大阻碍。传统上主要依赖于显微解剖技术来鉴定ccRCC的起源和类型，随着单细胞RNA测序技术的不断发展，现如今已将单细胞RNA测序技术应用于ccRCC的异质性研究，为ccRCC的分类和功能研究提供了方法。YOUNG等人[20]通过将健康肾组织细胞与ccRCC、乳头状肾细胞癌1型(papillary renal cell carcinoma, pRCC)、肾母细胞瘤来源的肿瘤细胞簇的单细胞转录组进行分析，发现ccRCC和pRCC都具有近端肾小管来源的细胞亚型，其共同特点是高表达VCAM1,而低表达SLC17A3和SLC7A13。另一项对ccRCC单细胞和批量RNA的测序发现ccRCC肿瘤上皮细胞和表达VCAM1的近端小管细胞高度相似[21]。以上研究都提示了ccRCC可能来源于表达VCAM1的近端小管细胞。

2.2 ccRCC的免疫浸润

ccRCC是免疫和血管浸润严重的癌症类型之一[22],也是一种免疫敏感型肿瘤。例如：高度血管化的ccRCC表现出高度的免疫细胞浸润[23],因此转移性ccRCC通常对抗血管生成治疗和免疫治疗有反应[24,25,26,27],如T细胞增殖细胞因子IL-2和干扰素(interferon, IFN)-α2b的系统性免疫治疗。但其通过诱导T细胞衰竭获得免疫逃避机制是导致免疫治疗失败的主要原因之一[28]。为探索ccRCC的免疫治疗新途径，近年来研究人员通过单细胞RNA测序对肿瘤中的异质性淋巴和髓系免疫细胞进行了全面表征[29,30,31,32]。ZHANG等人[21]通过单细胞测序对比ccRCC和嫌色性肾细胞癌的组成，他们发现ccRCC中免疫细胞比例高达30%,而嫌色性肾细胞癌中免疫细胞仅为5%,这充分说明了ccRCC内高度的免疫异质性。

全面了解基因特征以充分了解特定免疫细胞群体在ccRCC中的作用，不仅可以识别进展期ccRCC患者的免疫失调决定性因素，还可以作为选择患者、评估免疫治疗获益的有力工具。例如：一项研究绘制了3例未接受治疗的ccRCC患者的25 688个免疫细胞图谱，他们发现ccRCC组织中浸润性CD8+T细胞和耗竭性CD8+T细胞显著增加，但CD4+T细胞浸润不明显，并且其中CD8+T细胞亚群中增殖型的浸润与较差的预后相关，提示瘤内复杂的免疫细胞可能影响ccRCC患者的预后[33]。同样通过单细胞测序描绘瘤内复杂的细胞图谱，揭示免疫细胞亚群的动态间转化不仅影响细胞谱系的发育和分化，且调控肿瘤的免疫治疗。如SHI等 人[34]发现不仅在ccRCC组织中CD8+T细胞的浸润显著增加，而且在ccRCC的癌栓中CD8+T细胞也显著增加。其中CD8+T细胞中存在高度富集祖细胞耗竭表型亚群，这一特征在癌栓中更加明显，并在后续的研究中发现祖细胞耗竭性CD8+T细胞的癌栓对免疫检查点抑制剂(immune checkpoint blockade, ICB)治疗具有较高的敏感性，且与较好的预后相关。另一项研究也表明，耗竭性CD8+T细胞可增强肾癌免疫检查点抑制剂的疗效[35]。值得注意的是耗竭性CD8+T细胞中的TOX相关基因高度富集可能影响T细胞的分化，提示了TOX可能是影响 PD-1治疗的重要原因之一[36,37]。总之，以上研究都表明，增殖型CD8+T细胞的浸润预示较差的生存率，而祖细胞耗竭性CD8+T细胞浸润的ccRCC对PD-1治疗有反应，TOX则可能是预测免疫治疗患者反应的潜在标志物之一，为临床精确筛选目标患者具有指导意义。

Treg细胞是一种重要的免疫抑制细胞，正常情况下在机体中起到维持免疫平衡的作用。而在肿瘤患者中Treg细胞通过抑制先天和适应性抗肿瘤免疫，可使肿瘤细胞免受免疫检测，从而使肿瘤细胞发生免疫逃逸[38]。近年来，越来越多的研究已证实ccRCC浸润性Treg细胞具有抗肿瘤免疫作用。如BRAUN等人[39]研究发现，ccRCC患者肿瘤中浸润Treg细胞的频率与分期呈正相关。另一项研究通过单细胞RNA测序显示ICB治疗完全缓解的患者拥有更低的Treg浸润[40]。这些研究为ccRCC提供了潜在的治疗靶点。

自ICB问世以来，彻底改变了癌症的治疗方式，然而过去大部分的研究主要聚焦于T淋巴细胞，但在免疫杀伤过程中并非只有T细胞参与，很多其他类型的免疫细胞也参与了免疫杀伤的过程。例如，肿瘤组织中B淋巴细胞及出生后在非淋巴组织中出现的免疫细胞有组织聚集体三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures, TLSs),它们是免疫治疗的重要组成部分，与免疫治疗的预后密切相关，甚至影响患者对免疫治疗的反应[41]。早在2018年就已有研究发现可切除黑色素瘤的免疫新辅助治疗中对治疗有反应的患者B细胞标志物显著升高[42]。2020年一项针对肾癌免疫B细胞的单细胞测序分析发现，在肾细胞癌ICB应答者中表达MZB1、JCHAIN和IGLL5的B细胞水平显著高于无应答者，且B细胞高表达患者的生存期显著高于低表达患者，推测B细胞可能有助于ICB治疗后T细胞的应答，并通过组织学评估发现B细胞在TLSs中高度富集，提示B细胞可能与TLSs一起通过某种作用机制促进ICB治疗的反应[43]。虽然目前对B细胞及TLSs在ccRCC中的具体机制仍不清楚，但这必然会成为未来研究的重要方向之一，如提高B细胞在ccRCC组织中浸润，以及增加ccRCC中三级淋巴结构的密度，有望成为ccRCC治疗的新途径。

现如今虽然通过单细胞RNA测序技术对ccRCC的瘤内异质性有了更加深入的了解，但对其如何影响ccRCC的发生发展仍处于初步阶段。未来通过单细胞多组学深入理解ccRCC的免疫细胞分化、细胞重编程及细胞转分化等基因调控网络方面具有重要意义，认识这一过程有利于指导临床筛选目标患者及制定个性化治疗方案。

2.3 ccRCC的复发与转移

目前，肾癌术后的主要随访手段是影像学检查，然而对于早期复发性肿瘤的形成通过影像学检查很难发现。因此，寻找有效的检测标记物在早期复发性肿瘤中的监测中显得尤为重要。一项研究表明[44],ccRCC中C1Q、APOE和TREM2阳性巨噬细胞浸润以及LILRB5蛋白的高活性与其术后复发时间较短具有显著相关性。提示C1Q、APOE和TREM2阳性巨噬细胞及LILRB5蛋白的高活性可作为ccRCC术后检测复发的生物标记物，也是潜在的治疗靶点。

在ccRCC中，癌细胞的远处转移是最为致命的威胁，远处转移灶不仅难以发现且治疗手段有限。因此，寻找转移相关基因(metastasis-associated genes, MAGs)及标记物，对ccRCC早期诊断、个体化治疗及预后判断显得尤为重要。ZHANG等人[45]研究发现ALDH1A1、BHLHE41、BNIP3等17个与转移和预后具有显著相关的基因，为晚期ccRCC预后及药物开发提供有力的依据。BRAUN等人[39]通过对13例不同临床分期ccRCC患者肿瘤组织和癌旁非肿瘤组织中的免疫细胞进行单细胞RNA测序分析，以确定疾病进展与免疫细胞浸润的变化关系。他们发现在晚期转移性ccRCC中，促炎性M1样巨噬细胞减少，抗炎性M2样巨噬细胞增加，且功能失调的CD8+T细胞和M2样巨噬细胞共同出现在晚期ccRCC中，并表达支持T细胞功能障碍和M2样极化的配体和受体，在接下来的随访中他们发现M2样巨噬细胞的浸润增加与较差的生存率相关，这可能是ccRCC潜在的靶向免疫抑制途径，是晚期转移性ccRCC患者潜在的治疗策略。

上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指细胞失去上皮极性特征向间质细胞表型转化的过程，已证实参与多种来源于上皮细胞肿瘤的侵袭和转移。ccRCC是一种来源于近端小管上皮细胞的肿瘤，既往通过传统测序技术已发现ccRCC中EMT现象的存在。如今通过单细胞RNA测序技术进一步证实了ccRCC中EMT现象的存在，如SHI等人[34]研究发现，在ccRCC和癌栓中肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage, TAM)标志物高表达，且在癌栓中发现胞外基质重塑相关通路显著增强，如EMT、胞外结构组织、血管生成。并通过细胞与细胞间互作分析明确了肿瘤-间质相互作用与ccRCC患者生存率降低显著相关，这为靶向细胞外基质的治疗提供了理论基础。值得注意的是ccRCC中VHL肿瘤抑制因子的失活高达98%,VHL的缺失可导致HIF-1α和HIF-2α的激活[46]。COWMAN等人[47]发现TAM中高度表达HIF-1α,且HIF-1α不仅与肿瘤的高等级和转移的增加明显相关，而且与总体生存率的降低相关。另外有研究发现，耐药 患者中富含TAM且CD207+TAM相关的患者总体生存率更差[40,45]。总之，以上这些研究结果为晚期转移性ccRCC患者提供潜在的治疗靶点。

3、总结与展望

单细胞RNA测序以其精准的方法来描述ccRCC的转录组学，不仅改变了我们对ccRCC的认识，更改变了我们对生物系统的理解。虽然我们很难预测单细胞测序技术未来会有怎样的发展，但单细胞测序技术在单细胞水平上探索ccRCC的发生发展及转移机制，必然会成为今后的研究热点。未来结合单细胞多组学技术和空间转录组技术，探索特征相对较差的免疫细胞，如抗原提呈及调节性细胞，可为ccRCC免疫治疗机制提供理论支撑。

基金资助:河北省自然科学基金资助项目(编号:H2021402018);

文章来源:沈冲,赵建军.基于单细胞RNA测序技术探讨肾透明细胞癌发生发展的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(23):4436-4440.