宫颈癌在全球女性肿瘤死亡原因中排第4位，严重威胁着女性生存质量。据统计该病死亡率有所降低，但其晚期易转移性特点导致其预后仍较差[1]。目前提出的免疫疗法受到大量学者的关注，有文献指出若能通过对免疫机制的控制可达到消除肿瘤细胞生长的作用[2]。究其作用机制可得，癌细胞及微环境中多种细胞表面附着免疫检查点蛋白抑制剂CTLA4单抗和PD1单抗受体和配体，分别阻断CTLA4对T细胞的抑制信号和阻断肿瘤细胞、巨噬细胞对T细胞的抑制作用，解除此类靶点对T细胞活性的负性调控作用、增强T细胞对肿瘤杀伤作用。有研究表明该免疫机制符合肿瘤破坏免疫机制过程，即细胞毒性T细胞（CD8+）和调节性T细胞（FoxP3+）被激活，释放出大量巨噬细胞（CD68+）而造成免疫系统失调[3]。有文献评估各种癌细胞免疫特征发现CTLA4、PD1单抗与人乳头状瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染发生和发展密切相关，而持续性高危型HPV感染是导致宫颈癌最主要原因[4]。因此将免疫疗法应用于宫颈癌治疗和预后有着重要价值，已有文献报道过免疫治疗复发性宫颈癌的作用[5]。但综合国内外文献发现，对免疫治疗最佳时机及定量分析该疗法对宫颈癌患者的应用价值的具体报道较少。因此本研究以行手术切除的宫颈癌标本为研究对象，旨在探讨细胞毒性T细胞、巨噬细胞和调节性T细胞在复发性宫颈癌患者中的免疫特征，以期找出复发性宫颈癌最佳免疫治疗方案，现作以下报道。

1、资料与方法

1.1临床资料

回顾性分析2018年1月至2018年12月于我院确诊并收治入院的58例复发性宫颈癌患者的临床资料，通过医院病理档案室随机选取2018年1月至2018年12月经宫颈癌根治术切除的存档蜡块58例。患者及其家属均对本研究知情同意，并统一签署知情同意书，本研究符合我院伦理委员会相关规定并已审核通过。纳入标准：(1)实验室、影像学检查见癌细胞，经病理学检查确诊为宫颈鳞状细胞癌或宫颈腺癌，分期参照FIGO分期标准；(2)经过一线或以上化疗后进展的复发或转移宫颈癌患者，或不能耐受化疗的复发或转移宫颈癌患者；(3)均行盆腔脏器切除术得病理标本；(4)临床资料完整，各项检查完善；(5)年龄25～65岁。排除标准：(1)合并严重心、肝、肾疾病；(2)有其他恶性肿瘤；(3)术前使用过免疫抑制剂类药物；(4)病理标本不完整；(5)合并活动性结核或脑膜转移。研究对象平均年龄（45.53±10.36）岁；IA2、IB1、IB2、IIA、IIB、IIIA、IIIB、IVA、未知分期分别为3、16、10、3、10、3、7、2、4例；肿瘤等级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级分别为6、22、23、7例；组织学分类中腺癌和鳞状细胞癌分别为19和29例；随访记录中存活和患病分别为32例和26例。

1.2实验方法

收集患者一般资料包括年龄、身高、体质量、家族史、病程、治疗情况、分期、组织病理学类型、随访情况。选择肿瘤标本进行免疫组织化学（SP法）染色，选择最具代表性标本；每份标本载玻片采用多重免疫组织化学PD1检查点实验板染色，以20倍放大率捕获每个载玻片5个非重叠图像场，并使用inForm®软件分析；在细胞膜上测定肿瘤和肿瘤周围区段中PD1、PD-L1、CD8+、CD68+、FoxP3+表达。表型密度计数以细胞中出现棕黄色颗粒为准，采用细胞计数板（美国BIO-RAD）确定密度百分比。免疫细胞及流式术检测CD8+、CD68+T细胞上FoxP3+的表达：调整肿瘤细胞悬液细胞数为1×107/ml，取200μl加入0.05 ng/L PGMEA、10 ng/L BFA、1 mol/L伊诺霉素37℃孵育5 h,PBS漂洗，加入10μlPE-Cy7-CD4抗体，4℃避光孵育0.5 h,PBS漂洗，再加入10μl FITC-IL-17A抗体，4℃避光孵育0.5 h,PBS缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪（美国贝克曼库尔特，型号：CytoFLEX LX）检测CD4+FoxP3+细胞占CD4+T淋巴细胞的比例；同上，取200μl细胞悬液加入10μl FITC-CD25抗体、10μl PE-Cy7-CD4抗体，4℃避光孵育0.5 h,PBS漂洗，加入PE-FoxP3抗体，4℃避光孵育0.5 h,PBS缓冲液重悬细胞，采用流式细胞仪检测CD8+、CD68+T细胞上FoxP3+的表达。

1.3统计学分析

采用spss19.0统计软件，将因素资料数量化为计数资料后输入统计系统，计数资料（CD8+、CD68+、FoxP3+在正常宫颈及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级类型宫颈癌细胞中的阳性表达率）比较采用卡方检验；采用曼-惠特尼秩和检验比较PD1、PD-L1、CD8+、CD68+、FoxP3+表达；符合正态分布采用Pearson相关分析，不符合正态分布采用Spearman相关系数分析；多重比较采用Kruskal-Wallis秩和检验；作Kaplan-Meier存活曲线并采用对数秩和检验比较存活率；以P<0.05认为差异有统计学差意义。

2、结果

2.1 CD8+、CD68+、FoxP3+在不同组织学类型宫颈癌细胞中的阳性表达情况

采用单因素方差分析，CD8+、CD68+、FoxP3+在正常宫颈及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类型宫颈癌细胞中的阳性表达率比较P<0.05；进一步两两比较，CD8+、CD68+、FoxP3+阳性表达率在Ⅰ级和Ⅱ级、Ⅰ级和Ⅲ级间比较P<0.05；见表1、图1。

2.2 CD8+、CD68+T细胞上FoxP3+的表达

免疫FoxP3+可诱导CD8+、CD68+凋亡，见图2。

2.3 CD8+、CD68+、FoxP3+在肿瘤与肿周的表型密度比较

PD1、CD8+、D68+、FoxP3+表型密度在肿瘤和肿周中有统计学差异（P<0.001,P<0.001,P=0.042,P<0.001),PD-L1表型密度在肿瘤和肿周中无统计学差异（P=0.523）；进一步比较，肿瘤组织中PD-L1表型密度高于PD1(P<0.05），而肿瘤周围组织中PD-L1、PD1表型密度比较P>0.05;CD8+、CD68+表型密度1 CD8+CD68+FoxP3+均高于FoxP3+(P<0.05）；见图3。

表1 CD8+、CD68+、FoxP3+在不同组织学类型宫颈癌细胞中的阳性表达情况

图1 CD8+、CD68+、FoxP3+在不同组织学类型宫颈癌细胞中的阳性表达图（×200)

图2 Foxp3诱导CD8+、CD68+细胞凋亡

图3表型密度分析

2.4肿瘤组织CD8+、CD68+、FoxP3+与PD1、PD-L1相关性

PD1表达与肿瘤组织区段中细胞CD8+、CD68+呈显著正相关关系（P<0.05），与FoxP3+无关（P>0.05），见表3。

表3 CD8+、CD68+、FoxP3+与PD1、PD-L1相关性

2.5肿瘤周围组织CD8+、CD68+、FoxP3+与PD1、PD-L1相关性

PD1表达与肿瘤周围组织区段中CD8+、FoxP3+呈显著相关关系（P<0.05），与CD68+无关（P>0.05);PD-L1表达与肿瘤周围组织区段中CD68+呈显著相关关系（P<0.05）；见表4。

表4 CD8+、CD68+、FoxP3+周围组织与PD1、PD-L1相关性

2.6 CD8+、CD68+与FoxP3+相关性

CD68+表型密度与FoxP3+呈显著相关关系（P<0.05）；高CD8+/FoxP3+比率和低CD8+/FoxP3+比率的肿瘤无进展生存或总生存率无统计学差异（P=0.092）；见图4、5。

图4 CD68+与FoxP3+相关性

图5 CD8+/FoxP3+比率高低与生存率相关性

3、讨论

复发性宫颈癌包括宫颈癌复发和未控，复发分为放疗后、术后、术后放疗后复发，主要发生于盆腔，也可出现远处转移。据统计，约15%～61%宫颈癌患者在完成初始治疗2年内发生转移或复发[6]。临床资料显示约5%患者初诊时为IVA期，晚期、复发性宫颈癌患者基本失去手术或放疗机会[7]。迄今在对20种以上的细胞毒药物分别及联合治疗研究中，发现复发性或晚期宫颈癌最有效药物为顺铂，且联合治疗显著改善患者生命质量[8]。但大量资料显示，采用以化疗为主的个体化治疗具有临床处理困难、治疗有效期短、不良反应重等缺点[9]。在陈赛英等报道显示，出现上述不良情况主要与患者体能状况、复发或转移部位、病变程度及初始治疗方式不同有关[10]。随着分子靶向治疗的研究和成熟，参考国内外文献发现若能对癌细胞反应标志物作出具体分析，提高潜在靶标而为临床提供合理依据。

目前PD1单克隆抗体已完成初步试验并显示出较好安全性，其稳定的药代动力学特征提示其具有初步抗肿瘤有效性。越来越多的学者对宫颈癌免疫细胞表达作出研究，发现其在治疗原发疾病上有着显著成果[11,12]。黄述斌等将PD1单抗应用于不同宫颈癌治疗发现PD-L1在各类肿瘤细胞中有不同表达，提示对某些肿瘤细胞对免疫检查点抑制不同[13]。探究宫颈癌发病机制可得，宫颈癌是正常宫颈组织、宫颈炎、宫颈上皮内瘤样变逐渐发展而来。而上皮内瘤样变转变为宫颈癌过程包括了癌基因、抑癌基因、细胞因子的参与，及细胞周期连续复杂。戴滋瀛等研究指出，在分子水平基础上寻找出有效的生物标志物对宫颈癌诊断、治疗及预后有较高价值[14]。在肿瘤发生过程中，DNA复制影响着细胞周期，CD8+为DNA复制中必需一部分，其结合、解离、编码和复制提示DNA合成启动。CD8+的表达情况可反映癌细胞增殖，其在分化好及衰老静止的细胞内呈低表达，而在大量增殖细胞中呈高表达；另CD8+可较敏感反应暂时静止但具有增生潜能的细胞。而细胞过度失调增殖能力是肿瘤细胞特有表现，若增殖越快、CD8+表达越强，提示细胞浸润能力越强。在汪佳等报道中发现，FoxP3+与自身免疫疾病、感染和肿瘤均有密切相关性[15]。究其机制可得，FoxP3+是一类具有天然免疫抑制功能的CD4+细胞亚群，可调节机体免疫机制，有效对抗炎症和维持机体平衡。FoxP3+在阴春霞等报道中被认为是细胞转录调控机制的敏感性指标之一，其指出可为肿瘤疾病免疫治疗提高有利线索[16]。Bao等文献通过FoxP1敲除小鼠发现，其在维持细胞稳态和抑制性功能中有重要价值，并阐明了其相关分子机制[17]。且该文献中发现FoxP1能调控FoxP3转录水平及其稳定性，提示FoxP3和FoxP1具有相互协同作用，可影响细胞抑制性功能[17]。本研究结果显示，CD8+、CD68+、FoxP3+阳性表达在不同组织类型宫颈癌细胞中的阳性表达率有所差异，说明探讨CD8+、CD68+、FoxP3+对肿瘤发生和发展有一定意义，与上述文献较为一致。另本研究分析CD8+、CD68+、FoxP3+与病理特征相关性中发现，其与病理特征呈显著关系，进一步说明其对临床判断的重要价值。

对肿瘤细胞和周围细胞免疫特征进一步分析发现，肿瘤周围免疫细胞表达高于肿瘤细胞；PD1、PD-L1表达与在细胞中的CD8+、CD68+、FoxP3+相关性有所区别。对相关特征进一步分析，CD8+、FoxP3+表达降低，可增强免疫抑制效果。早在谢丽叶等文献中就已提出，所有肿瘤均表达不同程度膜性PD-L1[18]；且赵宇飞等提出PD-L1表达高于PD1[19]。在本研究中PD-L1表型密度在肿瘤和肿周中无显著差异，肿瘤组织中PD-L1表型密度高于PD1，较符合上述文献。提示对PD1和PD-L1抗体的研究应考虑其位置、程度和强度，对阳性定义作出更精准判断。探究T细胞作用机制发现，受到肿瘤转运该病其密度降低，CD8+细胞表达增强。探究其相关性发现，PD1表达与肿瘤组织及周围组织区段中CD8+呈显著相关关系，提示CD8+能识别肿瘤相关抗原。出现上述情况考虑与趋化因子表达增加有关，在肿瘤环境下免疫机制更具特异性。第2个方面考虑与CD8+增殖减少而炎性因子增加，细胞免疫机制受到总体抑制。在T细胞适应性中已有学者提出，CD8+抗肿瘤活性可通过PD1、PD-L1阻断剂得以恢复，提示T细胞主要是降低炎性反应来促进肿瘤细胞生长和发展，但其并未完全失活[20,21]。因此，可通过提高T细胞活性使其发挥抗肿瘤作用。探讨与不同密度的CD8+发现，高CD8+/FoxP3+比率肿瘤无进展生存或总生存率无差异，说明两者在协同抗癌作用中有重要作用。在对CD8+、CD68+、FoxP3+表型密度差异相关性进一步分析中发现，CD68+与FoxP3+呈显著相关关系，提示CD68+高活性取决于FoxP3+密度，说明FoxP3+可提高CD68+活性，提高抑癌效果。CD68+FoxP3+

综上所述，CD68+与FoxP3+表达相关性提示可通过增强其表达进而提高CD8+活性，为治疗复发性宫颈癌提供免疫疗法依据。但由于本研究样本数量有限，随访时间较短且均为回顾性分析，免疫治疗应用于复发性宫颈癌应在临床工作中进一步总结经验，不断完善并结合各细胞免疫特征，为治疗提供更有力依据。

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