桥本氏甲状腺炎（Hashimoto'sthyroiditis,HT）是自身免疫性甲状腺疾病（AIDS），女性发病率高，具有淋巴细胞浸润的病理学特征，尤其以T细胞浸润和滤泡破坏为主，临床可见甲状腺结节或肿大，甲状腺自身抗体水平明显上升，伴有或不伴有甲亢，HT与甲状腺癌存在密切关系，被认为是甲状腺乳头状癌（papillarythyroidcarcinoma,PTC）的癌前病变[1]。

目前西医治疗上常规给予左旋甲状腺素维持有效甲状腺激素水平[2]、手术、免疫疗法等，但存在副作用大、易复发、手术后遗症等问题，均无法改善自身免疫对甲状腺的持续损伤，目前尚无针对HT病因的西药[3]，只有当病情发展到甲减[4]，增加甲状腺素，续终身用药。近年来中医药治疗HT显示出独特优势，在中医学中属于“瘿病”范畴，中医学认为本病的产生与患者的情志状况，身体体质以及饮食水土失宜有关。其病位定于肝、脾，病机为情志不畅，致肝失条达，肝郁气滞，气滞则津停血瘀；或是脾虚湿盛生痰，痰气阻滞，血脉运行不畅，脉络不通，致气滞、痰凝、血瘀互结壅滞于颈前部而发病。

肝郁脾虚、气滞痰阻为其主要辩证特点，辩证分型为气滞痰阻型、阴虚火旺型、脾肾阳虚型，以气滞痰阻型最常见[5]，当以疏肝行气，健脾化痰之逍遥散加半夏厚朴汤加减[6]，肝郁气滞为其复合病机中关键病机，故以逍遥散为主方，配以半夏厚朴汤行气化痰，组成加味逍遥散，由当归、茯苓、白芍、白术、柴胡、半夏、厚朴、紫苏叶组成，大量研究发现加味逍遥散治疗气滞痰阻型HT具有较好的疗效[7,8,9]，但其分子作用机制尚不明确，本研究旨在从生物信息学角度深入挖掘加味逍遥散治疗气滞痰阻型HT的作用机制。

1、材料与方法

1.1 加味逍遥散有效成分收集及初筛

利用中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP)[10](http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、中草药分子机理分析的中药综合数据库（TCMID)[11]、中药整合药理学平台（TCMIP)[12]，收集加味逍遥散中当归、茯苓、白芍、白术、柴胡、半夏、厚朴、紫苏叶8味中药的主要化学成分。根据人体对药物吸收、分布、代谢及毒性的药动学参数[13]，以口服生物利用度[14](OralBioavailability,OB）≥30%，化合物类药性[15](DrugLikeness,DL）≥0.18为筛选条件[16]，初步筛选出加味逍遥散有效活性成分。

1.2 有效成分靶点基因预测及“中药-疾病-证型”交互靶点

通过有机小分子生物活性数据库（PubChem)[17](https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）收集各有效活性成分，以2D、3D结构保存为SDF格式。将有效活性成分导入整合靶点预测网站服务器（SwissTargetPrediction)[18](http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库预测有效活性成分相关靶点，剔除无化学结构、靶点有效活性成分，获得中药靶点。

通过Pubmed中“MeSH”检索功能检索“HashimotoDisease(MeSH）”，收集所有检索词。将“桥本氏甲状腺炎”的所有检索词纳入人类基因数据库（GeneCards)(https：//www.genecards.org/）数据库中，高级检索获得疾病靶点。

通过TCMIP(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/）数据库中整合药理学分析工具中证型相关分子挖掘选项，采用“反向筛选-以方测证”方法，以“气滞痰阻证”“气滞痰阻咽喉证”为证，反向筛选证型靶点。

通过BioinformaticsGent(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）中VandePeerLab在线工具取交集获得“加味逍遥散”∩“桥本氏甲状腺炎”∩（“气滞痰阻证”∪“气滞痰阻咽喉证”）的“中药-疾病-证型”交互靶点，并绘制韦恩图。

1.3 交互靶点蛋白互作（proteinproteininteraction,PPI）网络构建

通过String[19](https：//string-db.org/）数据库，将所得到的交互靶点导入，选择MultipleProtenin，限定物种为Homosapiens，设定最低要求互动分数为中度可信度0.400[20]，得到PPI网络相关信息。

将导出的PPI相关信息中Node1、Node2、Combinedscore值导入Cytoscape软件，使PPI网络相关信息网络图可视化，并利用Networkanalyzer计算Degree值，并进行可视化。

采用Cytoscape中APP功能CytoHubba的Degree、Betweenness、Closeness算法，进行亚网络拓扑分析，自设定取3种亚网络拓扑分析中前10位基因，将3种算法筛选出的基因取并集，整合出共同靶点关键基因。

1.4 交互靶点GO和KEGG富集分析

利用WebGestalt[21](http：//www.webgestalt.org/#）数据库，将交互靶点进行GO与KEGG通路富集分析。初步设定基本参数，物种为“Homosapiens”，采用“ORA”(Over-RepresentationAnalysis）算法分析，选用“FuntionalDatabase”子数据库，进行GO和KEGG富集分析。进阶参数设定中，设定“SignificanceLevel”P<0.05，余为默认设置。收集BP、CC、MF、KEGG富集分析数据，进行“Weightedsetcover”分析，并绘制火山图。

利用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）数据库同时对亚网络拓扑分析的关键基因进行KEGG富集分析，结合P值及文献对富集分析结果绘制“靶点-通路”弦图，进一步聚焦关键靶点参与疾病调控的机制。

2、结果

2.1 加味逍遥散有效活性成分筛选

通过TCMSP[10]、TCMID[11]、TCMIP[12]数据库，收集加味逍遥散中当归、茯苓、白芍、白术、柴胡、半夏、厚朴、紫苏叶8味中药的主要化学成分，初步筛选后获得加味逍遥散有效活性成分，当归2个，茯苓15个，白芍13个，白术7个，柴胡17个，半夏13个，厚朴2个，紫苏叶14个，基本信息如表1。

表1加味逍遥散有效成分及其基本信息

2.2 中药有效活性成分靶点预测与“中药-疾病-证型”交互靶点筛选

通过SwissTargetPrediction数据库对候选化合物相关靶点进行预测，剔除无化学结构及无靶点化合物，并整合重复靶点，获得加味逍遥散中当归、茯苓、白芍、白术、柴胡、半夏、厚朴、紫苏叶8味中药共637个中药靶点。

通过GeneCards数据库数据，收集得到“桥本氏甲状腺炎”靶点，共得到681个疾病靶点。

通过TCMIP数据库，收集得到气滞痰阻证中“气滞痰阻证”“气滞痰阻咽喉证”靶点，共得到1198个气滞痰阻证证型靶点。

采用BioinformaticsGent中VandePeerLab在线工具取交集获得“加味逍遥散”∩“桥本氏甲状腺炎”∩（“气滞痰阻证”∪“气滞痰阻咽喉证”）的“中药-疾病-证型”交互靶点共43个（表2），并绘制韦恩图（图1）。

2.3 “中药-疾病-证型”交互靶点PPI网络构建

利用String数据库及Cytoscape软件对交互靶点进行蛋白互作网络分析，并除去与交互网络无联系的靶点，得出PPI网络图（图2），根据Networkanalyzer分析中Degree值设定节点大小，Degree值越大，节点越大，其中1≤Degree值<9为粉红色；10≤Degree值<19为紫色；20≤Degree为红色，结果见表3。

对PPI网络进行亚网络拓扑分析，整合Degree、Betweenness、Closeness算法的拓扑网络图见图3，取并集整合后得到关键基因13个，分别为丝氨酸/苏氨酸激酶1(AKT1）、雌激素受体1(ESR1）、前列腺素-内过氧化物合酶2(PTGS2）、肿瘤坏死因子（TNF）、凝血因子II(F2）、白介素-6(IL-6）、白介素2-(IL-2）、半胱天冬酶3(CASP3）、血管内皮生长因子A(VEGFA）、HRas原癌基因、GTPase(HRAS）、雄激素受体（AR）、腺苷脱氨酶（ADA）、乙酰胆碱酯酶（Cartwright血型）（ACHE）。

表2“中药-疾病-证型”交互靶点

图1“中药-疾病-证型”韦恩图

图2交互靶点PPI网络图

2.4 “中药-疾病-证型”交互靶点GO和KEGG富集分析

BP富集结果，共富集246个生物过程，Weightedsetcover分析出10个最相关生物过程，根据“PValue”升序排列，主要富集于循环系统过程、对氧气水平的反应、腺体发育、上皮细胞增殖、白细胞活化的调节、对类固醇激素的反应、白细胞与细胞的粘附、突触信号转导的调控、脂肪酸代谢过程、离子迁移的正调控等生物进程。根据“Ratio”“PValue”“FDR”值绘制火山图。

CC富集结果，共富集70个细胞成分，Weightedsetcover分析出10个最相关细胞成分，根据“PValue”升序排列，主要富集于神经细胞体、内质网腔、膜面、细胞外基质、富含ficolin-1的颗粒、轴突部分、微体、细胞的顶端部分、受体复合体等细胞组分。根据“Ratio”“PValue”“FDR”值绘制火山图。

MF富集结果，共富集12个分子功能类别，Weightedsetcover分析出6个最相关分子功能类别，根据“PValue”升序排列，主要富集于类固醇结合、氧化还原酶活性、蛋白激酶C结合、有机酸结合、细胞外基质结合、辅因子结合等分析功能。根据“Ratio”“PValue”“FDR”值绘制火山图。

表3交互靶点Drgree值

图3Degree(A）、Betweenness(B）、Closeness(C）算法亚网络拓扑图

KEGG富集结果，共富集105条信号通路，Weightedsetcover分析出10条最相关信号通路，根据“PValue”升序排列，主要为肿瘤途径、AGE-RAGE信号通路、VEGF信号通路、MicroRNA信号通路、EGFR酪氨酸激酶信号通路、巨细胞病毒感染通路、HIF-1信号通路、蛋白聚糖肿瘤通路等信号通路。根据“Ratio”“PValue”“FDR”值绘制火山图（图4）。

13个关键基因DAVID数据库富集分析于28个主要KEGG信号通路，结合共同靶点KEGG结果及HT文献报道结果，对主要8条相关通路绘制“靶点-通路”弦图，结果见图5。

3、讨论

HT与遗传因素、心理因素、社会因素、生物化学因素等多因素有关，其发病机制与免疫、内分泌、细胞增殖分化等有关。HT是自身免疫性甲状腺疾病，是临床常见的甲状腺炎症，患者以甲状腺肿大、获得性甲减为主要临床表现[22]。目前尚无针对HT病因的西药[3]，只有当病情发展到甲减，增加甲状腺素，续终身用药[4]。中医学治疗HT具有独特的优势，气滞痰阻证是HT最常见证型，当以疏肝行气，健脾化痰之加味逍遥散治疗，本研究以气滞痰阻型HT为研究对象，加味逍遥散由当归、茯苓、白芍、白术、柴胡、半夏、厚朴、紫苏叶8味中药组成，具有治疗气滞痰阻的作用。运用网络药理学的方法来探讨加味逍遥散治疗气滞痰阻型HT的分子机制，发现其多靶点、多途径、多通路的特点。

图4GO-KEGG富集分析结果

图5“靶点-通路”弦图

本研究整合多个中药-活性化合物数据库，收集加味逍遥散化合物并根据OB、DL值进行初筛后，获得其中药有效成分，根据有效成分的化学结构对中药的靶点进行算法预测分析，共得到加味逍遥散中8味中药637个靶点。同时整合GeneCards疾病数据库、TCMIP证型数据库，获得681个HT疾病靶点，1198个气滞痰阻证证型靶点。以气滞痰阻型HT为特色，构建“中药-疾病-证型”韦恩图得出气滞痰阻型HT共有83个，其中有43个与加味逍遥散交互，为加味逍遥散治疗气滞痰阻型HT的靶点，基于PPI结果分析IL6、VEGFA、AKT1、CASP3、TNF、HRAS、PTGS2等在其中发挥着重要作用，是加味逍遥散治疗气滞痰阻型HT的关键靶点。GO、KEGG富集分析结果显示，加味逍遥散主要在胞体区、轴突区、细胞外基质等多组分，通过VEGF、miRNA、HIF-1信号通路、肿瘤途径等多通路，参与类固醇结合、氧化还原酶活性、蛋白激酶结合等分子功能，调控循环系统过程、突触信号转导、脂肪酸代谢等多生物过程在气滞痰阻型HT中发挥治疗作用。

CD4+T生成的细胞因子可分为Th1和Th2两种亚型，Th1/Th2细胞平衡是免疫细胞分泌细胞因子进行自我调节的重要条件，失衡可导致免疫介导的疾病[23],Th1细胞可介导细胞免疫、巨噬细胞活化、迟发性超敏反应及细胞毒性T细胞；而Th2细胞可介导体液免疫、B细胞活化及IgE的生成。HT可介导Th1型细胞免疫，即Th1型细胞因子上调，Th2型细胞因子也可上调，但相对Th1上调较慢，能引起甲状腺细胞结构破坏功能改变，IL-6等通过诱发并加重局部炎症反应促进HT的发生、发展[24]，从而出现甲状腺功能减退症，桥本氏甲状腺炎是细胞免疫和体液免疫相互作用的结果，外在表现为淋巴细胞亚群的失衡和细胞因子变异[25]。

Papanas等[26]研究发现HT患者中IL-6水平升高，TNF-α水平升高，两者具有显著相关性。本研究中IL-6属Th2型细胞因子，TNF家族中TNF-α、TNF-β属Th1型细胞因子，两者在本研究中相互作用较明显，因此可以初步推断出加味逍遥散可能通过下调IL-6细胞因子，及下调TNF家族细胞因子，并维持Th1/Th2细胞因子平衡，减轻炎症反应，从而治疗气滞痰阻型HT。

血管内皮生长因子A(VEGFA）是PDGF/VEGF生长因子家族成员，在缺氧条件下受生长因子、细胞因子、促性腺激素、一氧化氮、低血糖和致癌突变等调节[27]，从而诱导血管内皮细胞增殖、迁移、分化，抑制细胞凋亡，参与血管新生的生理病理过程。Jebreel等[28]研究发现，HT疾病中广泛表达VEGF细胞因子，可能是HT血管新生及疾病转归的预测分子。VEGF信号通路在血管新生中发挥着重要作用，在炎症相关因子（如IL-6）和肿瘤生长相关因子（如TNF-α、TNF-β）刺激作用下释放VEGF，从而促进脑、肿瘤、甲状腺、肾、肺等组织器官中血管内皮细胞的增殖、迁移、分化。

HIF信号通路是机体缺氧的适应性通路，研究发现[29]，炎症反应可激活HIF-1α、HIF-β，上调下游VEGF分子表达介导VEGF信号通路，并反馈促进炎症因子如IL-6、TNF-α的产生。同时结合本项研究PPI、GO、KEGG结果可得出，加味逍遥散可能通过维持Th1/Th2平衡，调节炎症因子（IL6、TNF-α、TNF-β）表达，通过HIF信号通路介导VEGF在甲状腺细胞中广泛表达，通过VEGF信号通路参与调控甲状腺组织中血管新生的生理病理过程，从而在气滞痰阻型HT中发挥作用。

1995年Dailey等[30]最早提出HT与PTC之间关系之后，流行病学研究证实，HT患者PTC发病率明显升高，同时分子层次也存在相关性[31]。PTC合并HT的发病率呈迅速增长趋势，已经引起医学研究者的高度重视，PTC-HT的相关研究已成为内分泌领域的热点[32]，研究发现[33]HT是PTC的癌前病变，与癌基因突变与重排、免疫、内分泌等机制综合作用有关，PTC与血清促甲状腺激素（TSH）水平有关，即HT引起甲状腺机能减退，从而导致TSH水平的升高，升高的TSH刺激甲状腺滤泡细胞增生，从而促进了PTC的发展[34]。张艳等最新研究发现[35]HT是PTC发病的危险因素之一，与TSH水平升高和淋巴结数量有关，也与本研究KEGG富集分析与肿瘤通路结果一致，加味逍遥散可能通过降低淋巴结数目，调节炎症因子来维持Th1/Th2平衡，推测可能加味逍遥散能在HT转化成PTC中发挥作用，为后续研究HT合并PTC的预后及治疗提供了方向。

本研究从生物信息学角度对加味逍遥散治疗气滞痰阻证HT的作用机制进行探讨，初步得出加味逍遥散能通过多途径、多分子、多通路治疗气滞痰阻型HT，且提示HT与PTC存在药物治疗的相关性，为后续进一步研究加味逍遥散治疗HT提供了理论依据。本研究尚处于理论上预测探讨加味逍遥散治疗气滞痰阻型HT作用机制的阶段，下一步将以临床研究和实验研究进行相关验证工作，以明确网络药理学研究结果的可靠性。

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基金:湖南省卫生计生委科研计划课题项目(B20180739);湖南省大学生研究性学习和创新型试验计划(2018425);湖南中医药大学大学生创新型项目(201970).