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约氏疟原虫感染小鼠脾脏B细胞和NK细胞的检测

2021-01-27 428 上传者：管理员

摘要：为研究约氏疟原虫感染小鼠脾脏不同免疫细胞及其细胞因子的水平变化,将C57BL/6小鼠分为感染组和正常组,分别经小鼠尾静脉注射约氏疟原虫和生理盐水,8d后处死感染组和正常组小鼠并分离脾脏,制备单细胞悬液,然后利用流式细胞术检测小鼠脾脏B细胞和NK细胞及其表达的细胞因子IFN-γ、IL-12、IL-10的水平变化情况。结果显示,感染组小鼠脾脏B细胞的百分比[(60.36±3.43)%]较正常组[(54.41±1.67)%]明显升高(P<0.05),其表达IL-12的百分比[(0.70±0.10)%]较正常组[(0.43±0.02)%]明显升高(P<0.01),表达IL-10的百分比[(1.19±0.36)%]和IFN-γ的百分比[(0.16±0.03)%]与正常组[(0.70±0.31)%、(0.13±0.03)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。感染组小鼠NK细胞的百分比[(2.62±0.21)%]与正常组[(3.90±2.02)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05),其表达IFN-γ的百分比[(49.42±4.03)%]和IL-12的百分比[(4.06±1.64)%]与正常组[(53.31±9.43)%、(4.35±1.31)%]比较,差异无统计学意义(P>0.05),而表达IL-10的百分比[(6.88±0.97)%]较正常组[(4.89±0.43)%]明显升高(P<0.05)。该研究提示,机体感染疟原虫后,小鼠的特异性免疫发挥了一定的作用,其作用途径可能是升高B细胞表达的IL-12水平,而NK细胞可能通过升高IL-10的表达水平抑制其免疫功能。

关键词：
免疫细胞
约氏疟原虫
细胞因子
脾脏
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据WHO报告,2017年全球约有2.19亿疟疾病例,大多发生于撒哈拉以南地区,病死率高,我国经过积极的疟疾消除工作,近几十年来疟疾得到了良好的控制[1]。但境外输入性疟疾成为主要来源,输入性病例不断上升[2]。NK细胞已被证实可抵抗病毒和细胞内寄生微生物感染[3],B细胞介导的特异性免疫应答和体液免疫应答可保护机体[4,5],二者均分泌多种细胞因子如IFN-γ、IL-10和IL-2来抵抗感染[6,7]。

青蒿素类药物是治疗疟疾的首选药物,但其有一定的免疫抑制作用[8],副作用明显,如荨麻疹等[9],且有些虫株出现了耐药性。由于疟原虫逃避机体免疫作用的途径较多[10],也给疫苗研发带来了挑战。本研究探讨约氏疟原虫感染中NK细胞、B细胞及其表达的细胞因子的作用,旨在为阐明约氏疟原虫的耐药机制和疟疾疫苗的研发提供新方向。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1研究对象

6～8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠购于广州中医药大学实验动物中心,饲养于广州医科大学实验动物中心;约氏疟原虫(Plasmodiumyoelii)NSM株由厦门大学苏新专博士和李剑博士惠赠。

1.1.2试剂

Hanks液、红细胞裂解液、PBS购于生工生物工程(上海)股份有限公司;FCS、RPMI1640基础培养液购于ThermoFisherScientific公司;别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)-Cy7标记的抗小鼠CD19、PB450标记的抗小鼠CD3、藻红蛋白(phycoerythrin,PE)-Cy7标记的抗小鼠NK1.1、FITC标记的抗小鼠IFN-γ、PE标记的抗小鼠IL-12、APC标记的抗小鼠IL-10流式抗体购于Biolegend公司。

1.1.3实验仪器

CytoFLEXFCM购自BeckmanCoulter公司。

1.2方法

1.2.1感染模型的建立

取冻存的约氏疟原虫NSM株,注射到6～8周龄SPF级雌性C57BL/6小鼠腹腔进行疟原虫复苏。当复苏虫株的小鼠原虫率达8%左右时,精确统计原虫率和小鼠此时的红细胞密度。将10只6～8周龄雌性小鼠随机分为感染组和正常组(5只/组)。经尾静脉向感染组小鼠注射106个疟原虫(稀释到100μL生理盐水中),正常组小鼠同时给予等量生理盐水。

1.2.2标本采集

感染后第8天,颈椎脱臼处死2组小鼠,用75%的乙醇进行浸泡,剪开小鼠腹部皮肤及腹膜,钝性无菌分离小鼠脾脏。

1.2.3脾细胞悬液制备

将分离的脾脏置于筛网中(200目),加入1mLHanks液,用注射器内芯研磨并收集脾脏研磨液,将细胞悬液转移至离心管,离心(600×g,5min,4℃),弃上清液后加入10mLHanks液重悬细胞,离心,弃上清液,用Hanks液洗涤脾细胞2次。正常组小鼠脾细胞加入5mL红细胞裂解液,感染组小鼠脾细胞加入10mL红细胞裂解液,于室温下放置5min后分别向各管加入5mLHanks液终止红细胞裂解,离心,弃上清液。加入5mLHanks液重悬脾细胞,离心(600×g,5min,4℃),弃上清液。用4mL含5%FCS的RPMI1640培养液重悬上述操作所得的细胞沉淀,置于200目筛网滤过至15mL离心管,于血细胞计数板计算并记录细胞密度。

1.2.4FCM检测细胞亚群

将细胞浓度调整为每孔100μL中含有1.5×106个细胞,加入200μLPBS洗涤1次,离心,弃上清液,每孔加100μLPBS进行重悬。按照说明书用量将适量流式抗体加入细胞悬液中,涡旋振荡15s以混合抗体和细胞;4℃避光孵育30min后用2mLPBS缓冲液终止染色,离心(600×g,5min),弃上清液后重复洗涤细胞1次;最后使用250μL上机液重悬细胞。使用FCM对染色细胞进行检测,并用CytExpert软件分析检测结果。

1.3统计学处理

采用SPSS20.0软件进行统计分析,定量资料以x±s表示,两组比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1B细胞、NK细胞在约氏疟原虫感染小鼠脾脏中的百分比

分离感染组和正常组小鼠脾脏,制备单细胞悬液。通过FCM检测B细胞(CD3-CD19+)、NK细胞(CD19-CD3-NK1.1+)的百分比含量。结果显示,感染组小鼠脾脏B细胞百分比[(60.36±3.43)%]高于正常组[(54.41±1.67)%,P<0.05];感染组和正常组小鼠脾脏NK细胞百分比分别为(2.62±0.21)%、(3.90±2.02)%,二者差异无统计学意义(P>0.05)。(图1)

图1B细胞、NK细胞在感染组和正常组小鼠脾脏中的百分比

2.2IFN-γ在约氏疟原虫感染小鼠脾脏B细胞、NK细胞中的表达

分离感染组和正常组小鼠脾脏,制备单细胞悬液。通过细胞表面分子染色,检测IFN-γ在B细胞和NK细胞中的表达情况。结果显示,感染组和正常组小鼠脾脏B细胞表达IFN-γ的百分比分别为(0.16±0.03)%、(0.13±0.03)%,二者差异无统计学意义(P>0.05)。感染组和正常组小鼠脾脏NK细胞表达IFN-γ的百分比分别为(49.42±4.03)%、(53.31±9.43)%,二者差异无统计学意义(P>0.05)。(图2)

2.3IL-12在约氏疟原虫感染小鼠脾脏B细胞、NK细胞中的表达

分离感染组和正常组小鼠脾脏,制备单细胞悬液。通过细胞表面分子染色,检测IL-12在B细胞和NK细胞中的表达情况。结果显示,感染组小鼠B细胞表达IL-12的百分比[(0.70±0.10)%]较正常组[(0.43±0.02)%]明显升高(P<0.01)。感染组和正常组小鼠NK细胞表达IL-12的百分比分别为(4.06±1.64)%、(4.35±1.31)%,二者差异无统计学意义(P>0.05)。(图3)

图2IFN-γ在各组小鼠脾脏B细胞、NK细胞中表达的流式图

图3IL-12在各组小鼠脾脏B细胞、NK细胞中表达的流式图

2.4IL-10在约氏疟原虫感染小鼠脾脏B细胞、NK细胞中的表达

分离感染组和正常组小鼠脾脏,制备单细胞悬液。通过细胞表面分子染色,检测IL-10在B细胞和NK细胞中的表达情况。结果显示,感染组和正常组小鼠B细胞表达IL-10的百分比分别为(1.19±0.36)%、(0.70±0.31)%,二者差异无统计学意义(P>0.05)。感染组小鼠NK细胞表达IL-10的百分比[(6.88±0.97)%]较正常组[(4.89±0.43)%]明显升高(P<0.05)。(图4)

图4IL-10在各组小鼠脾脏B细胞、NK细胞中表达的流式图

3、讨论

脾脏是人体中最大的外周免疫器官,为固有免疫和特异性免疫发挥作用的共同场所。B细胞可通过分泌抗体和激活CD4+T细胞来发挥免疫效应,是机体免疫系统的重要组成成分。而B细胞家族成员中的调节性B细胞可分泌IL-35、IL-10等细胞因子,发挥免疫抑制作用[11]。NK细胞是固有免疫细胞的一种,可识别抗原成分,发挥自然杀伤作用。感染约氏疟原虫后,小鼠脾脏B细胞明显增加,而NK细胞减少,这提示机体感染约氏疟原虫后,体液免疫已发挥作用,而NK细胞介导的固有免疫过程可能还未起作用。

IFN-γ是Ⅱ型IFN,可以激活巨噬细胞的功能和增强NK细胞的杀伤作用[12]。同时其是促炎细胞因子的一种,能促进炎症反应过程[13]。也有研究发现,NK细胞分泌的IFN-γ在恶性疟原虫感染中发挥一定的作用[14,15]。在本研究中,小鼠感染约氏疟原虫后,脾脏B细胞和NK细胞表达IFN-γ的水平下降,但与正常组没有明显的统计学差异,这提示感染疟原虫后,机体在一定程度上并不是通过上调IFN-γ的表达水平来抵抗疟原虫感染的。

IL-12是机体内重要的细胞因子,主要由激活的免疫细胞产生,可驱动Th1对抗细胞内细菌或原虫的特异性免疫应答[16],调节Th1/Th2的比值,增强Th1的作用[17]。另外,IL-12的存在,可以增强NK细胞对恶性疟原虫感染红细胞的细胞毒性作用[18]。在本研究中,小鼠感染约氏疟原虫后,脾脏B细胞表达IL-12的水平升高,这提示机体可能通过上调B细胞表达IL-12的水平来发挥免疫作用。

IL-10为抗炎细胞因子的一种,可由多种免疫细胞产生,如CD4+T细胞、CD8+T细胞和B细胞等。同时人和鼠的NK细胞也可在各种外来病原微生物的刺激下产生IL-10[19,20]。其可以促进Th0向Th2转化,同时抑制Th1反应[21]。另外,也有研究发现,IL-10在感染约氏疟原虫小鼠的免疫调节功能中不起主要作用[22]。在本研究中,小鼠感染约氏疟原虫后,脾脏NK细胞表达IL-10的水平明显升高,而B细胞表达IL-10的水平没有升高,这提示小鼠感染约氏疟原虫后,可能通过上调NK细胞表达IL-10的水平来发挥一定的负性调节作用。

综上所述,本研究结果表明,C57BL/6小鼠感染约氏疟原虫后脾脏B细胞和NK细胞及其细胞因子均发生变化,但变化趋势不同。目前,关于疟原虫感染后机体免疫功能变化的研究结论不一,有研究发现,在疟原虫感染中,机体巨噬细胞被激活,产生IL-12促进NK细胞表达IFN-γ,IFN-γ又作用于巨噬细胞,激活T细胞发挥免疫保护作用[23]。此外,疟原虫感染机体免疫抑制的机制尚无定论,机体感染疟原虫后不仅可以抑制一些免疫细胞的功能,如DC和T细胞等[24],而且可上调转化生长因子β1和IL-10表达,起一定抑制作用[25]。本研究结果提示,机体在抗约氏疟原虫感染中,NK细胞不但没有发挥比较大的免疫保护作用,而且可能通过上调IL-10的表达水平来发挥一定的免疫抑制作用,而B细胞则通过上调IL-12的表达水平来激活NK细胞、T细胞功能发挥免疫保护作用。本研究结果可为进一步探讨约氏疟原虫对青蒿琥酯的耐药机制提供一定参考,且对疟疾免疫疫苗的研发具有一定意义。

参考文献：

[1]陈远东,屈志强,李萍.全球疟疾流行现状及我国输入性疟疾疫情[J].医学动物防制,2017,33(1):51-54.

[2]王亚丽,王煊,张彦平.2005-2013年全国本地感染与境外输入疟疾流行病学特征分析[J].中国媒介生物学及控制杂志,2015,26(2):120-126.

[3]周小青,李静,赵蕾,等.自然杀伤细胞通过树突状细胞调控衣原体肺部感染中Th17/Treg免疫应答平衡[J].山东大学学报(医学版),2019,57(4):15-19.

[4]黎文妍,王任翔,陈国娟,等.记忆B细胞能否分泌抗体[J].生物学教学,2018,43(11):65-66.

[5]刘秋莉,肖崇珺,黄牡丹,等.间充质干细胞对B细胞增殖及免疫调节功能的影响[J].中山大学学报(医学版),2019,40(2):195-203.

[7]黄小青,杨春.IFN-γ与乙型肝炎病毒感染相关性的研究进展[J].右江民族医学院学报,2018,40(6):603-606.

[8]胡俊平,李燕.青蒿琥酯免疫调节作用的研究进展[J].河南中医,2007,27(11):85-86.

[9]朱江川.青蒿琥酯治疗儿童疟疾疗效观察[J].中国药物与临床,2012,12(10):1358-1360.

[10]周雅盼,李娇,鲍丽,等.恶性疟原虫的免疫逃避机制研究进展[J].动物医学进展,2018,39(5):98-102.

[12]单增天,田岳凤,李雷勇,等.不同灸法对免疫抑制兔脾脏指数及细胞因子的影响[J].湖南中医药大学学报,2016,36(11):83-86.

[13]郭敏,杜建新.创伤性湿肺患者IL-6､IL-10与IFN-γ水平与危重程度的关系研究[J].解放军预防医学杂志,2019,37(3):82-84.