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生物信息学分析腹膜透析腹膜细胞的免疫相关基因差异表达

2023-07-12 145 上传者：管理员

摘要：应用生物信息学方法分析不同腹膜透析时间的腹膜细胞的免疫相关基因（IRGs）表达差异，探索参与腹膜损伤、腹膜纤维化的重要生物标志物。方法：下载基因芯片数据集GSE125498，利用GEO2R数据库分析平台筛选差异表达基因。从ImmPortPortal数据库下载IRGs列表，并筛选出差异表达的IRGs。应用DAVID、STRING生物信息学分析平台，及Cytoscape软件对筛选所得的差异表达IRGs进行生物学注释（GO）、信号通路富集分析（KEGG）及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。结果：与20例短期腹膜透析患者相比，在13例长期腹膜透析患者中筛选出差异表达IRGs 36个（|log2FC|>1.0，校正后P<0.05），其中35个上调基因，1个下调基因。GO分析结果显示差异表达IRG的生物学过程主要富集在免疫应答，细胞学组分主要定位于质膜，子功能主要富集在跨膜信号受体活性，KEGG信号通路主要富集在细胞因子-细胞因子受体的相互作用。在PPI网络中应用MCODE及cytohHubba模块筛选出的关键基因为CCR7、CD40LG、IL7R。结论：随着腹膜透析时间的延长，腹膜细胞的免疫应答活跃，相关基因CCR7、CD40LG、IL7R可能是腹损伤、纤维化形成的重要的免疫学标志物。

关键词：
免疫相关基因
差异表达
生物信息学
腹膜细胞的免疫
腹膜透析
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维持性腹膜透析患者的腹膜组织长期暴露于腹膜透析液中，其功能及结构会随着治疗时间的延长难以避免地出现损伤，最终向腹膜纤维化进展，致使超滤失败[1]。迄今腹膜纤维化的发生机制尚未完全明确，了解腹膜细胞在长期腹膜透析过程中生物学标志物的表达变化，对探索和防治腹膜纤维化的方法具有重要的研究指导意义。

1、资料与方法

1.1资料

从美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）下载基因芯片数据集GSE125498，该数据集使用Illumina HumanHT 12 v4.0芯片进行基因表达谱分析[2]。包含33例腹膜透析患者的腹膜透析流出液离心所得的腹膜细胞转录组基因表达谱，根据患者腹膜透析治疗时间的临床实践，以腹膜透析治疗时间24个月为分界点，将治疗时间≤24个月的患者归入短期腹膜透析，将治疗时间>24个月的患者归入长期腹膜透析，其中20例为短期腹膜透析患者，接受腹膜透析治疗时间2～24个月，男性占比60%，平均年龄46岁；13例为长期腹膜透析患者，接受腹膜透析治疗时间25～68个月，男性占比70%，平均年龄61岁。

1.2方法

采用GEO数据库提供的GEO2R数据分析平台分析并筛选短期及长期腹膜透析患者的腹膜细胞差异表达基因。在ImmPortPortal数据库下载免疫相关基因（immune related genes,IRGs），并筛选出差异表达的IRG。使用数据库注释、可视化和集成分析在线平台（Database for Annotation Visu‐alization and Integrated Discovery,DAVID）对筛选出的差异表达IRGs进行注释及富集分析，包括基因本体论（Gene Ontology,GO）分析及京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）信号通路富集分析，其中GO分析主要包括生物学过程（biological process,BP）、细胞学组分（cellular components,CC）、分子功能（molecular func‐tion,MF）。采用在线功能蛋白关联网络分析平台STRING 11.0进行蛋白-蛋白相关作用（protein-pro‐tein interaction,PPI）网络分析，分析结果采用Cyto‐scape 3.8.2软件构建PPI模型，最后应用MCODE及cytohHubba模块确定关键基因（hue gene,HG）。

2、结果

2.1差异表达基因分析

GEO数据库提供的GEO2R在线平台分析结果显示，与20例短期腹膜透析患者相比，13例长期腹膜透析患者共有7 072个下调基因（差异倍数，log2FC<0),6 004个上调基因（log2FC>0），如图1所示。将差异表达基因筛选条件设置为校正后P<0.05，且|log2FC|>1.0，最终共筛选出125个上调基因，及29个下调基因。

2.2差异表达IRGs分析

在ImmPort Portal数据库下载IRG列表，应用R4.05软件的ggvenn数据包筛选出36个差异表达IRGs，其中35个上调基因（ZAP70、PLA2G2A、FLT3LG、SEMA3E、KIR2DL4、SYTL1、TNFRSF4、LTB、CD79B、ITK、PI3、CCR7、GNLY、CXCR5、IL2RA、ANGPTL4、CD79A、S1PR1、APOBEC3H、CD19、SOCS1、IL7R、TNFRSF13B、PDCD1、PRKCQ、CACYBP、HLA-DOB、LCN2、HAMP、BACH2、CD3E、CD40LG、KLRD1、IL2RG、PLXNA3),1个下调基因（TNFRSF10B）。

2.3富集分析

采用在线生物信息分析平台DAVID对筛选出来的36个差异表达IRGs进行GO及KEGG信号通路富集分析，GO分析结果显示差异表基因生物学过程主要富集在免疫应答、信号转导、细胞表面受体信号通路、炎症反应、肿瘤坏死因子介导信号通路；细胞学组分主要定位于质膜、膜的组分、质膜外侧、质膜组分、细胞内；分子功能主要富集在跨膜信号受体活性、受体结合；KEGG信号通路主要富集在细胞因子-细胞因子受体的相互作用、原发性免疫缺陷、T细胞受体信号通路，见表1。

2.4 PPI分析

将36个筛选出来的差异表达IRG在STRING平台加载，分析并获得PPI模型，将分析结果导入Cytoscape3.8.2软件进一步调整并绘制PPI模型，应用MCODE及cytohHubba功能模块筛选出3个关键基因，分别为CCR7、CD40LG、IL7R，见图2。

图1长期与短期腹膜透析患者腹膜细胞基因差异表达火山图

表1 GO及KEGG信号通路富集分析

图2差异表达IRG的PPI图

3、讨论

随着腹膜透析时间的延长，腹膜难以避免地会发生腹膜损伤，出现相应的病理学变化，如新生血管的形成、间皮下致密层的增厚，腹膜间皮细胞减少等，严重者可导致腹膜纤维化发生[3]。腹膜纤维化是腹膜透析患者严重的慢性并发症之一，可引起有效腹膜透析面积减少，导致超滤和溶质清除功能降低，其造成的超滤失败是患者退出腹膜透析的最主要原因[4,5]。目前腹膜纤维化的发生机制尚未完全明确，但非生理性的腹膜透析液、尿毒症毒素状态、感染性腹膜炎及非感染性的微炎症状态与腹膜纤维密切相关[6]。腹膜细胞在上述因素反复刺激下启动自我修复系统，从而引起腹膜结构和功能的改变，这一过程包括了腹膜间皮细胞、炎症细胞、细胞因子、炎症因子、趋化因子等相互作用，通过多种信号转导途径，调节相关基因和蛋白的表达，最终造成腹膜功能及结构的改变[7]。

生物信息学是通过整合计算机技术、统计学和图形艺术，从生物的基因组和基因表达数据的大量和多样性中获取有价值信息的学科[8]。生物信息分析现已成为临床研究分析的重要组成，且已广泛应用于临床各种疾病的研究中，但与腹膜透析相关的生物信息分析仍鲜有报道。本研究比较不同治疗时间腹膜细胞的IRGs表达，旨在了解长期腹膜透析的腹膜细胞免疫相关的生物学信息，寻找腹膜损伤、腹膜纤维化的生物标志物。本研究结果发现随着腹膜透析治疗时间的延长，相关的基因CCR7、CD40LG、IL7R表达较为活跃，提示这些基因的表达可能是腹膜损伤、腹膜纤维化其中重要的节点。

CCR7是趋化巨噬细胞的重要趋化因子[9,10]。长期腹膜透析患者存在巨噬细胞活化、聚集有现象[11]。这可能是由于腹膜透析溶液中的葡萄糖降解产物和其糖基化终末产物诱导了巨噬细胞活化[12,13]。已有研究表明巨噬细胞参与了腹膜透析纤维化的发生、发展[14]。巨噬细胞有多种亚型，其中最主要的为M1和M2巨噬细胞两个亚型[15]。研究结果表明M1巨噬细胞是腹膜纤维化的重要介质，也有研究表明M1和M2型巨噬细胞均参与了腹膜纤维化的发生、发展[13,16,17]。CD40LG，即CD154（或gp39），是肿瘤坏死因子配体家族成员，其在单核细胞、B细胞、抗原呈递细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞等多种细胞上表达[18]。CD40/CD40L主要通过刺激核因子κB(NF-κB）增强细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶、生长因子和黏附分子的表达[19]。既往的研究已表明CD40LG与多种慢性炎症疾病的发病机制有关[20]。有研究结果发现在腹膜炎可诱导巨噬细胞表达CD40LG，另有研究指出持续性的高CD40LG水平可能与腹膜炎的复发有关[21,22]。IL7R，即白细胞介素7受体，IL7/IL7R可通过JAK/STAT5、PI3K/AKT/mTOR信号通路实现生物学功能，与多种肿瘤、免疫学疾病等有关，但迄今尚未有其关于腹膜透析的文献报道[23]。这提示IL7R可能是潜在的腹膜损伤的生物标记物，但这一假设需进一步实验加以验证。

总而言之，长期腹膜透析患者的腹膜损伤和腹膜纤维化是一个缓慢且复杂的生理病理学过程，目前具体发生、发展的机制尚未明确。本研究利用生物信息分析的方法显示免疫应答在长期腹膜透析患者的腹膜细胞基因表达较为活跃，提示免疫应答的相关基因表达可能参与了腹膜损伤和腹膜纤维化过程，其中相关基因CCR7、CCD40LG、IL7R的表达可能是重要生物学标志物。但本研究纳入样本量偏少，对研究结果的准确性存在一定影响，仍需扩大样本及进一步的体外实验加以验证。

参考文献:

[4]蒋晓露,施映枫,马晓燕,等.腹膜损伤生物学标志物的研究进展[J].中华肾脏病杂志,2021,37(1):

[6]张情,孙丽娜,聂春迎,等.腹膜透析相关性腹膜纤维化发生机制[J].中国中西医结合肾病杂志,2019,20(3):.

[7]林文珊,周添标.腹膜透析相关性腹膜纤维化发生机制及治疗新进展[J].实用医学杂志,2019,35(1)4-9.

[8]郭玉凤,张婷,张超,等.前胃泌素释放肽ProGRP生物信息学分析及抗原决定簇预测[J].中国免疫学杂志,2021,37(23);

基金资助:汕头市科技计划医疗卫生类别项目(汕府科[2019]11-43);汕头市中心医院2019年科研培育计划资助项目(汕中心医[2020]20);

文章来源:吴泽归,黄国海,曲廖准.基于生物信息学分析腹膜透析腹膜细胞的免疫相关基因差异表达[J].中国免疫学杂志,2023,39(07):1379-1382.