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慢性淋巴细胞白血病BTKi治疗后免疫功能重建研究

2024-01-29 105 上传者：管理员

摘要：目的：分析慢性淋巴细胞白血病(CLL)经布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(BTKi)治疗后的免疫功能重建情况。方法：收集2017年1月至2022年3月在福建医科大学附属协和医院血液科就诊的59例CLL患者的病历信息，对其诊断、治疗和实验室检查资料进行回顾性分析研究。结果：59例CLL患者中位年龄为60.5(36-78)岁；BTKi治疗1年后，51例(86.4%)的CLL肿瘤克隆(CD5+/CD19+)明显缩小，治疗前后分别为(46±6.1)×109/L和(2.3±0.4)×109/L(P=0.0013)，而非肿瘤克隆(CD19+减去CD5+/CD19+)无明显变化；免疫球蛋白IgA明显升高，治疗前后分别为(0.75±0.09)g/L和(1.31±0.1)g/L(P<0.001)，但IgG和IgM下降，分别为(8.1±0.2)g/L和(7.1±0.1)g/L(P<0.001)、(0.52±0.6)g/L和(0.47±0.1)g/L(P=0.002)。BTKi治疗前后CLL患者的T细胞亚群出现明显变化，表现为总T细胞数从(2.1±0.1)×109/L减少至(1.6±0.4)×109/L(P=0.042),CD4+细胞数从(0.15±6.1)×109/L增加至(0.19±0.4)×109/L(P<0.001),CD8+细胞数从(0.27±0.01)×109/L增加至(0.41±0.08)×109/L(P<0.001),NK/T细胞数从(0.11±0.1)×109/L下降至(0.07±0.01)×109/L(P=0.038)；白细胞介素(IL)-2表达上调、IL-4和干扰素γ表达下降，但IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子α表达变化不大；TCR和BCR组库多样性都得到恢复，完全缓解患者比部分缓解患者恢复更明显，完全缓解患者BTKi治疗前后TCR组库香农指数分别为0.02±0.008和0.14±0.01(P<0.001)，部分缓解患者分别为0.01±0.03和0.05±0.02(P>0.05)，而BCR组库香农指数分别是0.19±0.003和0.33±0.15(P<0.001)、0.15±0.009和0.23±0.18(P<0.05)。结论：BTKi治疗可以缩小CLL克隆，促进IgA表达，增加功能性T细胞数量，调节IL-2、IL-4、干扰素γ等分泌，改善肿瘤微环境的免疫调节状态；BTKi治疗还能促进TCR和BCR免疫组库多样性的恢复。BTKi治疗有助于CLL患者的免疫功能重建。

关键词：
CLL
免疫功能重建
免疫系统
布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂
慢性淋巴细胞白血病
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慢性淋巴细胞白血病（CLL）是一种成熟B细胞肿瘤，特征是单克隆B淋巴细胞在外周血、骨髓、淋巴结和脾脏中进行性蓄积[1]。CLL典型特征是容易发生免疫系统功能失衡，后者反过来又会增加继发第二肿瘤和感染的风险，这是CLL患者发病和死亡的主要原因[2,3]。B细胞受体（BCR）信号通路在CLL细胞中持续激活，从而驱动肿瘤细胞的存活和增殖[4,5]。布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi）能特异抑制BCR信号通路，治疗CLL，目前获批应用于临床治疗CLL的BTKi有泽布替尼、伊布替尼、阿卡替尼等。研究表明，BTKi不仅能阻断BCR通路，而且对肿瘤免疫微环境也存在调节作用[6]。有研究发现，BTKi无论联合利妥昔单抗还是维奈克拉，患者的无进展生存期都有明显改善[7]。然而，现有的临床研究大都关注BTKi对CLL肿瘤本身的影响，而BTKi对CLL患者免疫功能重建影响的研究却非常少。

本研究对CLL患者使用BTKi治疗1年前后的免疫功能相关指标进行回顾性分析，分别从肿瘤细胞克隆、免疫球蛋白、T细胞亚群、肿瘤微环境以及TCR、BCR多样性的变化等参数评估患者经BTKi治疗后的免疫功能重建情况。

一、资料与方法

病例资料

纳入2017年1月至2022年3月在福建医科大学附属协和医院血液科就诊的59例使用BTKi治疗的CLL患者，CLL诊断、临床分期和治疗情况均参照CLL国内诊断及疗效标准[8]。所有患者初诊时均行外周血流式细胞术免疫表型检测、相关免疫球蛋白检测、相关细胞因子分泌检测以及TCR及BCR组库多样性的检测。

治疗方案

因药物可及性及医保限制等原因，本研究中的BTKi是指泽布替尼和伊布替尼。27例使用泽布替尼（160mg bid),32例使用伊布替尼（420 mg qd）治疗，持续治疗时间都在1年以上。

二代测序技术检测BCR和TCR多样性

二代测序技术可以量化BCR和TCR的多样性。TCR和BCR的多样性是通过在互补决定区域3(CDR3）重组连接处的可变区（V），多样区（D）和连接区（J）基因的重排来实现的。结合高通量测序技术，对机体免疫组库的多样性及每种T、B细胞克隆的独特性序列组成和变化进行分析，从而全面评估机体的免疫状态，明确疾病与T、B细胞克隆组成及变化之间的关系。

ELISA检测细胞因子的分泌

分离CLL患者外周血血清，应用ELISA试剂盒（e Bioscience公司）检测外周血细胞因子，包括肿瘤坏死因子α(TNF-α）、干扰素γ(IFN-γ）和白细胞介素（IL)-2、IL-4、IL-6、IL-10。

流式细胞术检测CLL表面分子的表达

分离CLL患者外周血单个核细胞，检测细胞表面免疫抗原如CD3、CD4、CD8、CD16、CD56、CD10、CD19、CD22、CD20等分子的表达。

随访

通过查阅患者纸质及电子病历资料确认患者有关信息，对患者进行电话随访，随访时间截至2022年3月8日。无进展生存（PFS）指患者使用BTKi治疗后到发生疾病进展的时间。总体生存（OS）指患者使用BTKi治疗后到因任何原因引起死亡的时间。

统计学分析

采用Graph Pad Prism 8.0a、Excel、SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。所有数据根据相应的分布特征进行描述，符合正态分布数据采用x±SD描述，两样本间比较用t检验，3组及以上样本间比较采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

二、结果

CLL患者的人口统计学和临床特征分析

59例CLL患者中，男性31例，女性28例；中位年龄60.5(36-78）岁；Binet分期A期11例，B期22例，C期26例；Rai分期Ⅰ-Ⅱ期38例，Ⅲ-Ⅳ期21例。18例（30.5%）进行了染色体核型鉴定，其中1例克隆性异常：Add(2p),add(6p),add(7p),+21;1例复杂核型：47,XX,+12(14）/48,idem,+21(4）/46,XX[2];7例未检出核型，余为正常核型。33例（55.9%）进行了FISH检测，18例del13q,1例del11q,9例Trisomy 12(12三体），1例del17p，余未见明显异常。19例（32.2%）行免疫球蛋白重链基因可变区（IGHV）检测，结果显示13例发生突变，6例未发生突变。22例（37.3%）行TP53突变检测，结果显示7例发生突变，余15例未发生突变。1例检测出了Notch突变（1.7%）。

有7例（11.9%）出现了相关不良反应，包括2例中性粒细胞减少，等级分别为2级和4级；3例贫血，其中2例2级，1例3级；2例出现血小板减少症，分别为4级和2级；1例房颤；5例出现感染，其中3级2例，2级3例。共4例（6.8%）合并了第二肿瘤，分别为支气管肺癌、乳腺癌、泌尿系肿瘤、结肠癌各1例。1例出现了Richter转化。

BTKi对CLL克隆的影响

59例CLL患者BTKi治疗1年后，外周血绝对淋巴细胞计数出现明显下降，从（60±7.7）×109/L降至（4.2±0.8）×109/L(P<0.001);51例（86.4%）的CLL肿瘤克隆（CD5+/CD19+）明显缩小，从（46±6.1）×109/L缩小至（2.3±0.4）×109/L(P=0.0013）；非克隆B细胞（CD19+减去CD5+/CD19+）数目无明显变化，治疗前后分别为（0.31±0.1）×109/L、（0.35±0.1）×109/L(P>0.05）（图1）。

BTKi影响免疫球蛋白的表达

CLL患者在使用BTKi治疗1年后，Ig G和Ig M表达明显下降，治疗前后分别为（8.1±0.2)g/L和（7.1±0.1)g/L(P<0.001）、（0.52±0.6)g/L和（0.47±0.1)g/L(P=0.002);Ig A表达明显升高，治疗前后分别为（0.75±0.09)g/L和（1.31±0.1)g/L(P<0.001）（图2）。

BTKi对CLL肿瘤微环境中T细胞亚群的影响

BTKi治疗后，T细胞亚群出现明显变化，表现为总T细胞数从（2.1±0.1）×109/L减少至（1.6±0.4）×109/L(P=0.042),CD4+细胞数从（0.15±6.1）×109/L增加至（0.19±0.4）×109/L(P<0.001),CD8+细胞数从（0.27±0.01）×109/L增加至（0.41±0.08）×109/L(P<0.001),NK/T细胞数从（0.11±0.1）×109/L下降至（0.07±0.01）×109/L(P=0.038）（图3）。

BTKi影响有关细胞因子分泌

59例CLL患者使用BTKi治疗1年后，IL-2表达明显上调，IL-4、IFN-γ表达出现下降（图4），而IL-6、IL-10、TNF-α表达变化不大。

TCR/BCR组库多样性的变化

TCR和BCR组库多样性都得到恢复，完全缓解患者（38例）比部分缓解患者（5例）恢复更明显，完全缓解患者BTKi治疗前后TCR组库香农指数分别是0.02±0.008和0.14±0.01(P<0.001），部分缓解患者分别是0.01±0.03和0.05±0.02(P>0.05）；而BCR组库香农指数分别是0.19±0.003和0.33±0.15(P<0.001）、0.15±0.009和0.23±0.18(P<0.05）。完全缓解患者BTKi治疗前TCR和BCR组库香农指数亦有差异（P<0.001）（图5）。

三、讨论

CLL是一种B细胞恶性肿瘤，其特征为表达CD5+/CD19+B细胞的克隆扩增。尽管免疫化疗使CLL的治疗反应有了较大的提高，但具有高危因素（比如IGHV未突变）的患者除外，此外还有部分患者不能耐受免疫化疗相关不良反应[9]。如今，BTKi因其有效性和安全性已经成为CLL一线治疗的主要药物[10]。本研究回顾性分析了59例CLL病例，持续采用BTKi（泽布替尼或伊布替尼）治疗1年以上，发现BTKi不仅能有效抑制CLL克隆达到控制肿瘤的目的，还能促进正常免疫球蛋白恢复、刺激细胞因子分泌、激活T细胞亚群，以及促进TCR/BCR多样性恢复，从而加速CLL患者的免疫功能重建过程。

BTKi治疗后，患者外周血绝对淋巴细胞计数先短暂升高，一般高峰期在治疗3个月至半年，随后逐渐下降。Arruga等[11]也发现了类似现象，伊布替尼引起的淋巴细胞增多症在数小时内发生，基线绝对淋巴细胞计数高的患者增加速度相对缓慢温和，但下降消退很快。经过BTKi治疗，无论绝对淋巴细胞计数的相对变化如何，淋巴结、骨髓和脾脏的肿瘤负荷都会明显降低。BTKi治疗1年后，克隆性B细胞（CD5+CD19+）明显降低，而药物治疗对非克隆的B细胞影响不大。因此，绝对淋巴细胞计数、克隆性B细胞计数和β2-微球蛋白都是反映BTKi治疗后CLL肿瘤负荷变化的重要指标[12]。

低免疫球蛋白血症是CLL的主要表征之一。意大利研究小组随访了1 505例CLL患者，根据诊断时的免疫球蛋白变化将其分为4个亚组，共发现73例（4.8%）、149例（10%）、200例（13.2%）和1 083例（72%）患者分别被确诊为Ig M单克隆丙种球蛋白病（Ig M/CLL）、Ig G单克隆丙种球蛋白病（Ig G/CLL）、低免疫球蛋白血症和免疫球蛋白水平正常[13]。低丙种球蛋白血症可能反映存在更具侵袭性的CLL克隆[14]。本研究结果显示，BTKi治疗1年后患者Ig A水平明显升高，而Ig G和Ig M出现下降，一方面说明CLL患者的异质性，另一方面显示BTKi能有效纠正低免疫球蛋白血症。Ig A是含量最丰富的抗体亚型，几乎占机体全部免疫球蛋白的75%，其与单核细胞和粒细胞结合，可以清除循环中的免疫复合物[15,16]，且发挥这种清除作用时不会活化补体或产生明显的炎性信号，这对抑制由自身抗体引起的免疫反应很关键[17]，同时也部分解释了BTKi对控制CLL合并自身免疫性溶血性贫血有很好的效果。Sun等[18]研究发现，BTKi治疗后，Ig G在前6个月内稳定，在12个月时轻微下降，24个月时下降明显，Ig A在82%的患者中表达增加。14例患者在基线时Ig A正常，BTKi治疗6个月后，Ig M水平下降，此时Ig G、Ig A不变。原发性体液免疫缺陷的特征通常为血清Ig M升高，而血清Ig G和Ig A水平较低。BTKi治疗后Ig A表达升高，Ig G和Ig M表达下降更倾向于患者免疫功能恢复的表现。

本研究中笔者观察到BTKi治疗后，CLL患者的T细胞亚群逐渐得到恢复，抑制性细胞因子明显降低，如IL-4、IFN-γ。本研究还利用二代测序技术对TCR和BCR组库多样性进行了免疫重建评估，并用香农指数来量化。香农指数是对TCR/BCR多样性的一个定量分析，香农指数越高，代表细胞克隆的多样性越高，免疫系统越稳定。BTKi治疗1年后，TCR和BCR组库香农指数较治疗前明显增加，TCR和BCR多样性都得到恢复，且治疗获完全缓解者比部分缓解者恢复更明显。

本研究也有需要完善的地方。第一，这是一项单中心的回顾性研究，随访时间较短。第二，关于Ig G亚类（Ig G1、Ig G2、Ig G3和Ig G4）缺乏症，本研究并未得到更详细数据，无法拓展研究CLL合并免疫球蛋白缺乏对BTKi的治疗反应。第三，由于研究样本量有限，并未对染色体核型、FISH、基因突变等与免疫重建做相关性分析。第四，因为随访时间有限，BTKi治疗与感染发生的相关性并未纳入统计分析。

综上所述，本研究结果表明，BTKi治疗对CLL免疫功能重建有明显促进作用。

参考文献:

[8]张之南,沈悌.血液病诊断及疗效标准.3版.北京:科学出版社,2007:139-l44.

[12]许贞书,张金燕,战榕,等.40例慢性淋巴细胞白血病临床分析.中国实验血液学,2012,20(3):583-586.

基金资助:国家自然科学基金项目(82270175);福建省自然科学基金项目(2021J02040);

文章来源:王远丽,唐培霞,陈凯莉等.慢性淋巴细胞白血病BTKi治疗后免疫功能重建研究[J].中国实验血液学杂志,2024,32(01):1-5.