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脑出血后不同时间点小胶质细胞极化状态的实验研究

2020-10-16 1084 上传者：管理员

摘要：目的：观察小鼠脑出血后不同时间点小胶质细胞M1及M2型的转化，为促炎型M1型小胶质细胞向抗炎修复型M2型小胶质细胞的转化，减轻脑出血后神经功能损伤提供理论依据。方法：选取健康雄性ICR小鼠48只，随机分为假手术组、脑出血组，每组按术后时间点不同随机分为1d、3d、7d三个时间点，每个时间点8只。通过立体定位仪用微量注射器向尾状核注射Ⅳ型胶原酶0.5U制备脑出血模型，假手术组注射等量生理盐水。各组于术后对应时间点参照改良Garcia评分量表进行神经功能缺损评分后灌注取脑，采用蛋白免疫印迹检测M1型小胶质细胞标志物肿瘤坏死因子α、白细胞介素6，M2型小胶质细胞标志物脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子1（insulin-likegrowthfactor1，IGF-1）的含量；采用免疫荧光染色标记小胶质细胞M1型（Iba1+CD80）、M2型（Iba1+CD206），评价出血后血肿周围组织小胶质细胞活化状态。结果：脑出血组1d、3d、7d各时间点Garcia评分均较假手术组低，TNF-α、IL-6、BDNF及IGF-1的蛋白表达量均较假手术组增多（均P＜0.01）。脑出血后1d时M1型高于M2型小胶质细胞数量（38.33±1.53vs23.00±3.00，P=0.01）；3d时M1型同样高于M2型（66.33±3.06vs57.33±2.52，P=0.02）；7d时M1型低于M2型（33.67±1.15vs52.33±0.58，P＜0.01）。结论：脑出血急性期（1～3d）以M1型小胶质细胞为主，脑出血亚急性期（7d）以M2型小胶质细胞为主。

关键词：
小胶质细胞Ⅰ型
小胶质细胞Ⅱ型
小胶质细胞极化
脑出血
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脑出血是卒中的一种亚型，其发病率、致死率及致残率均较高，会带来一系列原发性和继发性脑损伤，导致后期预后不良[1]。小胶质细胞是中枢神经系统中发挥免疫功能的主要细胞，广泛分布于大脑各个区域，占成人神经胶质细胞群的10%[2,3]，在脑出血、脑梗死、神经退行性疾病等疾病中起着至关重要的作用，是目前研究的热点之一。在生理情况下，小胶质细胞处于静息状态。当中枢神经系统组织稳态受到干扰时，小胶质细胞被激活以维持内环境的稳定[2,3,4]。小胶质细胞从静息状态向活化状态转变是一个动态过程，活化的小胶质细胞根据其表面标志物及功能的不同，分为两种表型，M1型（促炎型/有害型）和M2型（抗炎型/保护型），二者细胞膜均高度表达Iba1[5,6]。M1通过经典途径活化形成，细胞膜上表达标志物CD80、CD86等，并分泌炎症因子，如肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6）等，加重脑出血后脑损伤；M2经替代途径活化而成，胞膜上表达特征性标志物CD206、CD23等，具有较强的吞噬能力，能够吞噬受损神经细胞和组织碎片，修复创伤，同时释放一些神经保护因子，如脑源性神经营养因子（brain-derivedneurotrophicfactor,BDNF）、胰岛素样生长因子1(insulin-likegrowthfactor1,IGF-1)[7,8]。目前有研究探讨了脑出血后M1型小胶质细胞抑制或促进M2型小胶质细胞转化的潜在方法和可能机制[9,10]，但小胶质细胞活化后不同亚型在脑出血后不同时间段的变化规律尚不完全清楚。因此，本实验观察脑出血后不同时间段活化后小胶质细胞不同亚型的动态变化，探讨脑出血后血肿的内源性可能清除机制。

1、研究对象与方法

1.1实验动物与耗材

1.1.1实验动物

健康雄性ICR小鼠（体质量25～30g），购于山西医科大学动物实验中心。分笼饲养，食物与水充足，12h/12h昼夜循环，饲养温度维持在25±1℃，湿度适中。

1.1.2抗体

(1)蛋白免疫印迹：兔抗-TNF-α（武汉爱博泰克生物公司），兔抗-IL-6、兔抗-IGF-1（北京博奥森生物技术有限公司），兔抗-BDNF单克隆抗体、兔抗-β-肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体（美国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（武汉博士德生物工程有限公司）；(2)免疫荧光检测：羊抗-Iba1多克隆抗体、仓鼠抗-CD80单克隆抗体、兔抗-CD206多克隆抗体、羊抗仓鼠IgGH&L二抗（AlexaFluor®647）（美国Abcam公司），异硫氰酸荧光素（FITC）标记的驴抗羊二抗、CoraLite594标记的羊抗兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.1.3其他耗材

Ⅳ型胶原酶（北京索莱宝生物科技有限公司），含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）的封片剂（北京索莱宝生物科技有限公司），脑立体定位仪（北京众实嘉合生物科技有限公司），数字切片扫描仪（匈牙利3DHISTECH公司）。

1.2实验分组

将48只ICR小鼠随机分为假手术组（24只）与脑出血组（24只），各组按术后不同时间点又分为1d、3d、7d三个时间点，每组每个时间点8只。各时间点先参照改良Garcia评分量表进行神经功能缺损评分，然后灌注取脑，其中5只进行蛋白免疫印迹，3只进行免疫荧光染色。

1.3小鼠脑出血模型制备

用5%水合氯醛（0.01mL/g）对小鼠行腹腔注射麻醉后，俯卧固定于脑立体定位仪上，将头背侧皮肤消毒、备皮，头正中切口，暴露颅骨，用颅骨钻于前囟后0.9mm，中线右1.5mm处钻一直径约1mm圆孔，用微量注射器在深4mm处（尾状核位置）缓慢注射0.5UⅣ型胶原酶，停针15min后缓慢退针，医用无菌骨腊封闭钻孔，消毒、缝合皮肤后放回笼中常规饲养。假手术组注射等量生理盐水。待小鼠术后清醒参照Rosenberg标准评分法[11]判定脑出血模型成功与否，无神经功能缺损为0分，评分在1分以上视为脑出血造模成功，评分越高神经功能损伤越重，造模失败或实验中途死亡的小鼠剔除数据后予以重新造模补充并统计。

1.4神经功能缺损评分

采用改良Garcia评分量表[12]进行行为学评分，该量表分为自发活动、肢体运动情况、前肢伸展情况、金属网状壁攀爬、躯干触碰反应、触须反应等6项，最高18分，最低3分，评分越低则神经功能损伤越重。

1.5蛋白免疫印迹（Westernblot）检测TNF-α、IL-6、BDNF、IGF-1蛋白表达

腹腔麻醉小鼠后开胸，经心脏灌注预冷PBS缓冲液，断头取脑，冰上操作取血肿周围脑组织，提取组织蛋白，按照组织10mg加入100μL裂解液，匀浆器匀浆，12000r/min4℃离心2min后取上清液。取部分上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninicacid,BCA）法测定蛋白浓度，按照蛋白100μL加上样缓冲液（5X)20μL的比例配制，沸水煮5min。按每孔30μg蛋白上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，后转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜上，用5%脱脂奶粉液室温封闭2h,TBST(trisbufferedsalinetween-20）缓冲液漂洗后，一抗TNF-α（1∶2000）、IL-6(1∶2000）、BDNF(1∶1000）、IGF-1(1∶2000),4℃孵育过夜；二抗（1∶5000）室温孵育2h,TBST缓冲液漂洗。加入显色剂进行化学发光，同时测定β-actin(1∶5000）表达作为参照，用Imagelab6.0软件进行半定量分析。

1.6免疫荧光检测

腹腔麻醉小鼠后经心脏灌注冰PSB缓冲液和4%多聚甲醛，于冰上断头取脑。将脑组织置于4%多聚甲醛，4℃过夜，然后在相同温度下于20%及30%蔗糖PBS缓冲液中进行梯度脱水。OCT（一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物）固定包埋后于-20℃下行冰冻切片，厚度10μm,PBS溶液漂洗5min×3次，山羊血清封闭30min，同时孵M1（抗Iba1抗体1∶200,CD801∶200）和M2（抗Iba1抗体1∶200,CD2061∶200）一抗后移至4℃，过夜后移至室温复温15min,PBS溶液漂洗5min×3次，室温、避光条件下孵二抗（驴抗羊IgG1∶50，羊抗兔IgG1∶300，羊抗仓鼠IgG1∶600)1h，避光漂洗（方法同上），滴加DAPI，盖盖玻片，数字切片扫描仪下观察切片。每张切片随机选取3个视野进行拍照，每个视野含红、绿、蓝三种荧光，分别代表CD80/CD206、Iba1、细胞核。采用盲法计数，每组三张照片中同时有该细胞则符合计数条件，否则舍去。

1.7统计学方法

采用SPSS22.0及GraphPad统计分析软件进行统计分析及图表绘制。计量资料符合正态分布采用表示，两组间比较采用独立样本t检验；组内不同时间点比较采用单因素方差分析，不满足方差齐性时，采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1两组小鼠神经功能缺损评分

假手术组小鼠无神经功能缺损表现，1d、3d、7d各时间点Garcia评分均为18分；脑出血组各时间点为7.25±2.43分、10.50±1.31分和13.25±0.88分。与假手术组相比，脑出血组各时间点Garcia评分均下降（均P<0.01);1d时神经功能缺损最重，各时间点两两比较差异均有统计学意义（均P<0.01）（图1）。

2.2两组小鼠TNF-α、IL-6的蛋白表达

假手术组1d、3d、7d各时间点的TNF-α及IL-6的蛋白表达量无明显变化。与假手术组相比，脑出血组各时间点的TNF-α及IL-6的蛋白表达量均增多（均P<0.01）；且以脑出血3d时最明显，与1d、7d相比差异均有统计学意义（均P<0.01），而1d与7d相比差异无统计学意义（图2）。

2.3两组小鼠BDNF、IGF-1的蛋白表达

假手术组1d、3d、7d各时间点的BDNF及IGF-1的蛋白表达量无明显变化。与假手术组相比，脑出血组各时间点BDNF及IGF-1的蛋白表达量均增多（均P<0.01）；脑出血组3d及7d的BDNF及IGF-1蛋白表达量与1d相比均增多（均P<0.01），而3d与7d相比差异无统计学意义（图3）。

2.4脑出血后M1、M2型小胶质细胞的动态变化

免疫荧光染色显示，假手术组各时间点几乎看不到活化的小胶质细胞，脑出血后1d时M1型高于M2型小胶质细胞数量（38.33±1.53vs23.00±3.00,P=0.01);3d时M1型的数量同样高于M2型（66.33±3.06vs57.33±2.52,P=0.02);7d时M1型低于M2型（33.67±1.15vs52.33±0.58,P<0.01）（图4～图5）。

3、讨论

小胶质细胞最先对急性脑损伤产生免疫应答，是中枢神经系统中重要的免疫细胞。研究证实，小胶质细胞与多种疾病的病理过程有关，比如脑梗死、帕金森病、阿尔兹海默症等[13,14]。在正常情况下，小胶质细胞处于静息状态，呈“分枝状”。脑出血后，小胶质细胞迅速做出反应，胞体增大，分枝缩短，呈“变形虫样”，吞噬受损细胞或组织碎片。小胶质细胞形态的转变呈动态演变过程，不同形态扮演不同的角色，发挥不同的作用。有证据显示，小胶质细胞有两种活化形式，M1型和M2型。M1型主要分泌大量促炎因子，如TNF-α和IL-6，进一步加重脑出血后脑损伤，其特异性表达CD80、CD86和组织相容性复合体Ⅱ等分子。M2型特异性表达CD206、精氨酸酶-1、IL-10等，释放IGF-1和BDNF，保护脑组织对抗损伤。

图1两组小鼠不同时间点神经功能缺损评分

图4两组小鼠不同时间点两种小胶质细胞极化状态（免疫荧光×400)

图5脑出血组不同时间点两种小胶质细胞数量变化

国内外对脑出血后小胶质细胞活化的动态变化的研究较少。本实验中，发现在脑出血急性期（1～3d)M1型小胶质细胞数量显著增加，出血后第3天达到高峰，同时，炎症因子TNF-α、IL-6的蛋白质表达水平升高，其变化趋势同M1型小胶质细胞数量变化基本一致，而M2型小胶质细胞数在3～7d明显增多，神经保护因子BDNF和IGF-1蛋白表达水平也同步上升。Lan等[15]认为在脑出血4h即能检测到M1，而M2在脑出血后24h后开始出现，脑出血第1天M1占主要地位；出血第3天M1数量仍在上升，但M1占活化小胶质细胞的比例开始下降，M2所占比例开始上升，作者认为M1型小胶质细胞向M2型转化是发生在脑出血前3d，与本研究结果基本一致。而Wan等[16]的研究发现M1在脑出血后4h显著增加并达到峰值，在第3天时仍保持在较高水平，而在第7天开始下降；M2的出现晚于M1，在脑出血后24h达到峰值，后开始下降直至第7天，与本研究相左，可能是由于实验分组、模型制备方法及抗体试剂不同等造成。

在脑出血急性期（1～3d），红细胞破裂后释放出大量血红蛋白到组织间隙，血红蛋白进一步分解产生血红素、一氧化碳及铁离子，这些有毒代谢产物可以强烈激活小胶质细胞，使其极化为M1型并产生大量炎症因子，诱发炎症反应导致血肿周围组织损伤，大量神经细胞死亡和血脑屏障破坏，使脑水肿加重，最终导致神经功能缺损严重。在脑出血后期（7d),M2型小胶质细胞占优势，M1型小胶质细胞数量相对较少，同时M2型小胶质细胞标志物BDNF、IGF-1蛋白表达水平上调。在该阶段，血肿基本处于稳定期，机体需要吞噬能力强并能促进组织修复的细胞参与脑损伤后的组织修复。M2型小胶质细胞能够强力吞噬红细胞和受损组织碎片，并分泌BDNF与IGF-1，促进神经再生和神经元存活，有利于脑功能恢复，减轻神经功能缺损症状。

综上所述，M1型（促炎型）小胶质细胞和M2型（抗炎型）小胶质细胞相伴产生，二者在脑出血后第3天同时达到高峰，其后以M2型小胶质细胞为主；提示M1型小胶质细胞可能与脑出血后早期水肿有关，而M2型小胶质细胞可能与脑出血后神经修复有关。于脑出血早期干预M1型小胶质细胞向M2型转变对于促进血肿清除，减轻早期脑出血后水肿形成，促进神经功能恢复可能具有重要意义，尚需进一步实验明确其潜在的临床价值。本研究的不足之处在于对于指标检测时间点的划分还不够细致，检测指标的选择还有待于进一步提升，为探明脑出血后继发性脑损伤机制和寻找有效的干预措施，后续将继续进行创新研究。

武翠梅,王改青,要振佳.小鼠脑出血后不同时间点小胶质细胞极化状态的实验研究[J].中国卒中杂志,2020,15(10):1094-1100.