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TARBP2降解AKAP12转录本促进人乳腺癌细胞转移

2023-08-02 90 上传者：管理员

摘要：研究乳腺癌细胞中反式激活反应RNA结合蛋白2(TARBP2)转录后调控转移抑制基因A激酶锚定蛋白12(AKAP12)表达的作用及机制。方法生物信息学方法分析TARBP2在乳腺癌中的表达及其与肿瘤转移间的关联和乳腺癌中TARBP2与AKAP12表达之间的关联。利用脂质体转染后药物筛选的方法在人乳腺癌细胞系MDA-MB-231中稳定过表达TARBP2。裸鼠成瘤实验检测肿瘤肺转移；RT-qPCR检测靶基因AKAP12表达及半衰期。荧光素酶报告基因实验检测调节基因3′非编码区(3′UTR)的能力。EMSA实验检测TARBP2结合3′UTR中的茎环结构。结果人乳腺癌组织中TARBP2高水平表达且与患者淋巴结转移密切相关；TARBP2显著促进MDA-MB-231细胞肺转移(P<0.05);TARBP2显著抑制AKAP12表达(P<0.01)及其mRNA半衰期(P<0.05);TARBP2显著降低含AKAP12 3′UTR的报告基因荧光素酶活性(P<0.05)并结合其茎环结构；人乳腺癌组织中TARBP2表达与AKAP12表达呈显著负性关联(P<0.001)。结论 TARBP2抑制AKAP12表达可能是其促进乳腺癌转移的机制之一。

关键词：
A激酶锚定蛋白12
乳腺癌
反式激活反应RNA结合蛋白2
恶性肿瘤
肿瘤转移
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乳腺癌已成为世界范围内女性发病率最高的恶性肿瘤。尽管临床上大部分乳腺癌患者接受了手术等辅助治疗，但仍有约30%～40%的患者发展为高死亡率的转移性乳腺癌。因此，深入解析乳腺癌的转移调控机制仍然十分必要。

反式激活反应RNA结合蛋白2(trans-activation response RNA-binding protein 2,TARBP2)是一种RNA结合蛋白[1],具有多种功能，包括调节肿瘤细胞周期进展[2]、血管生成[3]及侵袭与转移[4]等。研究显示该分子在不同类型癌中发挥抑癌或促癌截然不同的功能[5],这可能与癌类型有关。在乳腺癌中，TARBP2调节肿瘤转移的分子机制仍不完全清楚[6,7]。A激酶锚定蛋白12(A kinase anchor protein 12)是一种激酶支架蛋白，可抑制肿瘤细胞转移[8]。本研究旨在研究TARBP2调节AKAP12表达的分子机制及其介导乳腺癌细胞转移的作用。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞系及实验动物：

人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF7及HEK293细胞系[美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)]。SPF级6～8周龄雌性Balb/c裸鼠[北京维通利华实验动物技术公司，动物许可证号：SCXK(京)2021-0006]。

1.1.2主要试剂：

DMEM培养基与胎牛血清(Gibco公司),EMSA试剂盒(Pierce公司),RNA提取试剂盒与反转录试剂盒(大连宝生物公司)。引物合成(上海生工生物公司)。LipofectamineTM2000、G418和放线菌酮D(actinomycin D, ActD)(Sigma公司)。

1.2方法

1.2.1生物信息学分析人乳腺癌数据中TARBP2表达模式(包括Luminal, HER2+,TNBC等不同亚型乳腺癌)及其与肿瘤转移(N0、N1、N2、N3为淋巴结转移阶段)之间的关联(http: //ualcan.path.uab. edu/analysis-prot.html);分别分析两组来自不同数据集的乳腺癌患者(1 006例和1 100例)的癌组织中TARBP2表达与AKAP12表达间的相关性(数据集分别来自www.oncolnc.org和timer2.0数据库)。

1.2.2细胞转染与筛选：将细胞接种于6孔板，待细胞汇合度达到75%时，利用LipofectamineTM2000转染TARBP2-GFP表达载体至乳腺癌细胞内并用G418筛选单克隆细胞。

1.2.3细胞、小鼠的分组及处理：乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468及MCF7被分为TARBP2/GFP过表达组及GFP表达对照组；裸鼠被分为2组，6只/组，分别接种TARBP2/GFP过表达的MDA-MB-231细胞和相同数量的表达GFP的对照细胞，以检测肿瘤细胞体内转移情况。

1.2.4裸鼠成瘤及肺组织的HE染色检测病理：将3×106个过表达TARBP2-GFP的MDA-MB-231细胞或对照细胞分别皮下注射裸鼠乳腺脂肪垫处，观测60 d肿瘤生长。实验结束时取小鼠肺组织置于10%甲醛浸泡，固定、包埋行切片HE染色。

1.2.5 RT-qPCR检测靶mRNA:采用Trizol法提取总RNA,取1μg总RNA反转录获得cDNA。将特异性引物、cDNA以及PCR荧光试剂混合后于ABI-7500仪上进行检测。GAPDH作为内参用于分析靶基因mRNA的表达量。所用引物如下：AKAP12正向：5′-GGAGACACCCGAAATAATCGAACAGAT-3′,反向：5′-GTAGATTGTTTGGGTTCGCTTTCTTTGG-3′;GAPDH正向：5′-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCA T-3′,反向：5′-CATGTTCGTCATGGGTGTGAACCA-3′。

1.2.6 RT-qPCR检测mRNA半衰期：使用ActD处理细胞以终止新mRNA合成，分别于不同时间点收集总RNA,采用RT-qPCR检测不同时间点上AKAP12基因的含量。

1.2.7荧光素酶报告实验检测TARBP2与3′UTR的靶向关系：在HEK293细胞中共转染含不同基因3′UTR的报告子质粒以及TARBP2表达载体，36 h后收集总蛋白，利用荧光素酶报告检测系统测量荧光素酶活性。ACTB的3′UTR报告子作为阴性对照。

1.2.8 EMSA检测TARBP2与茎环结构间的结合：EMSA实验按试剂盒说明书进行操作。MDA-MB-231/TARBP2-GFP全细胞裂解液(whole cell lysates, WCL)使用RIPA裂解液收集。探针包括野生型(WT)及突变型(mutant),AKAP12-WT探针：5′-UGG UAUUUUGAUAGAUACUG-3′;AKAP122-mutant探针：5′-UGAAAUUUUGAUAGAUACUG-3′。

1.3统计学分析

采用SPSS18.0和GraphPad Prism 5.0软件对各实验结果进行统计学分析，每个实验均重复3次。结果数据以均数±标准差(x¯±s)表示。统计分析采用Student-t检验或One-way ANOVA。

2、结果

2.1人乳腺癌组织中TARBP2高水平表达且与乳腺癌转移相关

通过分析癌症基因组图谱项目(TCGA, The Cancer Genome Atlas)人乳腺癌数据集发现，与正常乳腺上皮组织相比，原发性人乳腺癌组织中TARBP2表达显著增加(P<0.001);与正常上皮组织比，在不同亚型乳腺癌组织中TARBP2表达显著增加(P<0.05);TARBP2表达水平与乳腺癌淋巴结转移显著相关(P<0.05)(图1)。

图1生物信息学分析TARBP2在人乳腺癌组织中的表达及其与转移之间的关联

2.2 TARBP2促进乳腺癌转移

在裸鼠移植瘤模型中，与对照组相比，TARBP2过表达组肺组织中转移性结节数量显著增加(虚线显示肺组织中肿瘤转移灶)(P<0.05)(图2)。

2.3 TARBP2降低AKAP12的基因表达及转录本的稳定性

在MDA-MB-231,MDA-MB-468及MCF7乳腺癌细胞中，与对照组相比，过表达TARBP2可按时间依赖性方式抑制转移抑制基因AKAP12的mRNA转录(P<0.01)并减少其转录本半衰期(P<0.05)(图3)。

2.4 TARBP2靶向结合AKAP12 mRNA 3′UTR中的茎环结构

与空载体对照组相比，TARBP2可显著降低含AKAP12基因3′UTR的报告子活性(P<0.05),ACTB基因的3′UTR报告子作为阴性对照(图4A)。野生型(WT)探针能与含TARBP2-GFP融合蛋白的全细胞裂解液产生RNA-蛋白复合物(RNA-protein complex, RPC),而有2个突变位点的失去茎环结构的“mutant”探针则不能产生任何复合体(图4B)。

2.5人乳腺癌组织中TARBP2表达与AKAP12表达呈显著负相关

在乳腺癌组织中TARBP2表达水平与AKAP12表达水平呈显著负相关(P<0.001)(图5)。

3、讨论

临床上肿瘤细胞转移引发器官衰竭是导致患者死亡的最大原因。因此，深入研究肿瘤细胞转移的机制对于预防肿瘤转移至关重要。然而，对于肿瘤细胞转移进程的分子调控机制仍不完全清楚。本研究探讨了TARBP2在乳腺癌细胞转移中的作用及机制并阐明了其乳腺癌组织中的表达模式。本研究发现TARBP2在乳腺癌组织中显著高表达并与乳腺癌淋巴结转移密切相关，与之前的报道相一致[9]。在体内TARBP2能够显著促进乳腺癌细胞向肺组织转移，对其分子机制研究发现，作为一种RNA结合蛋白能够直接靶向肿瘤转移抑制基因AKAP12的3′UTR中的茎环结构，从而降解其mRNA并抑制其表达，这表明TARBP2在乳腺癌转移中发挥促进作用。

图2 HE染色方法检测TARBP2对乳腺癌细胞体内转移的促进作用

图3 RT-qPCR检测TARBP2抑制AKAP12基因mRNA转录及半衰期

图4报告基因及EMSA实验检测TARBP2与AKAP12结合的能力

图5关联曲线分析人乳腺癌组织中TARBP2与AKAP12表达之间的关联

mRNA稳定性异常是细胞癌变后的一个典型特征。已有研究表明，TARBP2可通过降低多个靶基因的mRNA稳定性，比如APP、ZNF395[6]和thrombospondin1(THBS1)[3]参与肿瘤进展。

AKAP12是一种重要的肿瘤转移抑制基因[10],与乳腺癌等癌细胞转移及进展密切相关[11]。在本研究中，过表达TARBP2可下调AKAP12基因mRNA的表达水平及稳定性，从而促进乳腺肿瘤细胞转移。已有研究报道TARBP2靶向结合其靶基因中的RNA茎环结构(stem-loop structure)[12]。在本研究中，利用EMSA实验证实TARBP2与AKAP12转录本3′UTR中的茎环结构相结合，证实了TARBP2的识别结合RNA空间构象的能力。值得注意的是，在人乳腺癌临床样本中也存在TARBP2与AKAP12基因表达水平之间的显著负相关性，表明本研究的基础研究结论在临床样本中被验证准确，是否强调TARBP2-AKAP12轴在调节乳腺癌细胞转移中发挥重要作用，值得进一步研究。

综上所述，TARBP2在乳腺癌细胞转移中发挥促进功能，其可通过直接靶向转移抑制基因AKAP12基因的3′UTR中的茎环结构降解其mRNA,可能是该分子发挥乳腺癌转移促进作用的机制之一。

基金资助:济南市卫生健康委员会科技计划项目(2018-1-21);北京协和医学院中央高校基本科研业务费专项资金资助项目(3332019012);

文章来源:王继辉,曹吉烈,张立军等.TARBP2降解AKAP12转录本促进人乳腺癌细胞转移[J].基础医学与临床,2023,43(08):