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人参皂苷Rg3对乳腺癌骨转移大鼠疼痛的缓解作用及机制研究

2024-03-14 78 上传者：管理员

摘要：目的:研究人参皂苷Rg3缓解乳腺癌骨转移大鼠痛觉行为的作用及机制。方法:采用大鼠乳腺癌细胞注入胫骨骨髓腔内构建乳腺癌骨转移疼痛模型；随机分成假性手术组、模型组以及人参皂苷Rg3给药组；连续3天静脉注射人参皂苷Rg3;记录大鼠痛觉行为学变化；分子对接分析人参皂苷Rg3与蛋白质的结合；免疫荧光和免疫印迹法检测各组动物脊髓组织炎症相关蛋白表达变化。结果:乳腺癌骨转移可导致骨组织损伤，诱发大鼠机械痛敏、热痛敏及自发痛。同时脊髓胶质细胞和NLRP3炎症小体激活，促炎因子IL-1β表达上调，抗氧化因子Nrf2和GPX4表达下降，线粒体氧化损伤相关蛋白DHODH和细胞色素C表达增加。人参皂苷Rg3给药后，大鼠机械痛、热痛和自发痛缓解，脊髓炎症信号下降，抗氧化Nrf2/GPX4信号增加，线粒体过氧化物信号下降。分子对接显示人参皂苷Rg3可结合Nrf2。结论:人参皂苷Rg3激活Nrf2介导的抗氧化反应，降低脊髓炎症，从而缓解癌痛。

关键词：
NLRP3炎症小体
人参皂苷Rg3
癌痛
神经炎症
线粒体
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癌性疼痛(简称癌痛)是晚期肿瘤患者最常见、最痛苦的症状之一，主要临床表现为持续的背景痛、爆发痛、痛觉超敏以及痛觉过敏，严重影响患者日常生理功能和生活质量[1]。60%以上的癌症晚期会发生骨转移，激活疼痛信号并经感觉神经纤维传入脊髓及中枢，从而引发严重疼痛[2]。针对癌痛的治疗药物主要是阿片类、类固醇、双磷酸盐等。但由于存在耐受性、药物成瘾性等不良反应，仍有约三分之一癌症患者存在疼痛治疗不足的情况[3]。因此，对癌痛机制的研究有助于疼痛的管理和治疗。

神经炎症是促进神经元兴奋和维持慢性疼痛的主要因素，表现为神经胶质细胞激活和炎症介质释放[4]。在癌痛进程中，脊髓胶质细胞被激活并释放大量促炎介质，如白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)[5]。NLRP3(NOD-,LRR-and pyrin domain-containing protein 3)炎症小体是控制IL-1β成熟的关键信号。NLRP3激活导致炎症小体募集，激活前半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1),促进IL-1β的成熟和释放[6]。因此，靶向抑制NLRP3炎症小体介导的神经炎症是缓解癌痛的潜在方法。

人参皂苷Rg3(Rg3)是从人参中分离出来的甾体皂苷，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及镇痛的生物学功效。人参皂苷Rg3可降低促炎介质水平和增加抗炎细胞因子产生[7],也可诱导巨噬细胞极化加速炎症消退[8],可调节炎症因子和疼痛相关氨基酸水平从而在福尔马林痛、角叉菜胶痛[9]以及切口痛[10]等不同模型动物中发挥抗伤害作用。然而，目前人参皂苷Rg3的抗炎镇痛作用机制尚不明确。在本研究中，建立了乳腺癌骨转移疼痛模型，尾静脉给药人参皂苷Rg3,分析其对行为、形态学和蛋白质表达的影响。旨在阐明人参皂苷Rg3在神经炎症和癌痛中的作用及其病理机制，为人参皂苷Rg3在癌痛治疗方法的应用提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 动物及分组

27只雄性SD(Sprague Dawley)大鼠(6～8周，150～180 g)购自湖北省实验动物中心。本研究动物实验经湖北科技学院伦理委员会批准(2022-03-042),并尽力降低动物痛苦。大鼠随机分为3组(9只/组):假性手术组(Sham)、模型组(Model)、人参皂苷Rg3药物处理组(Rg3)。

1.2 主要试剂及仪器

RIPA(Radioimmunoprecipitation assay buffer)裂解液(P0013B)、SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)凝胶快速配制试剂盒(P0013B)、BCA(bicinchoninic acid)蛋白浓度测定试剂盒(P0011)、QuickBlockTM Western封闭液(P0252)、QuickBlockTM免疫染色封闭液(P0260)等常用试剂均购自上海碧云天生物技术有限公司；anti-IL-1β(A16288)、anti-GFAP(glial fibrillary acidic protein A19058)、anti-Iba1(ionized calcium-binding adaptor molecule 1,A19776)、anti-NLRP3(A24296)、anti-caspase-1(A0964)、anti-Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,A0674)、anti-GPX4(glutathione peroxidase 4,A1933)、anti-DHODH(dihydroorotate dehydrogenase, A13295)、anti-Cyto C(cytochrome C,A13430)、HRP标记山羊抗兔IgG、荧光二抗Alexa Fluor 488(AS053)和Alexa Fluor 555(AS057)购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；Anti-cleaved-caspase-1(AF4005)购自江苏亲科生物研究中心有限公司。Olympus IX73荧光显微镜(Olympus, 日本);全自动石蜡切片机(Thermo, 美国);LAS500凝胶成像系统(GE,美国);高速冷冻离心机(Eppendorf, 德国)。

1.3 动物建模及药物处理

培养MRMT-1大鼠乳腺癌(RPMI1640培养基、10%FBS、1%L-谷氨酰胺、2%青霉素和链霉素),收集细胞并重悬于HBSS(Hanks' Balanced Salt Solution)溶液。大鼠经戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹膜麻醉、剃毛消毒、胫骨上半部分开口，细胞悬液(3×105个/10 μL)注射到左侧胫骨髓腔内，骨蜡封口。Sham组动物注射相同体积HBSS缓冲液。手术14天后，Rg3组大鼠尾静脉给药10 mg/kg人参皂苷Rg3连续3天[11,12],模型组注射同等剂量的溶剂。人参皂苷Rg3溶于二甲基亚砜，使用前用生理盐水10倍稀释。

1.4 行为学检测

机械痛阈值测定：大鼠适应30分钟，von Frey细丝(Stoelting, 美国)刺激左后爪，缩足或舔爪视为阳性反应，反义则为阴性反应，记录6次数据。将反应模式转换为机械缩足阈值(paw withdrawal threshold, PWT)表征机械痛。自发缩足次数记录：大鼠适应结束后，观察并记录每5分钟内自发缩足或舔爪次数，记录3次。用于表征自发痛。热痛阈值测定(paw withdrawal latency, PWL):大鼠适应结束后，用光照射(温度为45 ℃～65 ℃)刺激左后爪直到缩足或舔爪，记录反应时间。

1.5 骨X-射线及苏木精-伊红(H&E)染色

行为学结束后，处死大鼠，分离胫骨暴露于X-射线并成像；同时，胫骨组织经10%EDTA脱钙、脱水、石蜡包埋并切为4 μm的切片。骨组织切片经二甲苯和梯度乙醇脱蜡、苏木素染细胞核、氨水返蓝、伊红染色、乙醇脱水、中性树胶封片并至于显微镜下观察。

1.6 形态学检测

行为学测定结束后，大鼠深度麻醉后经心脏灌流固定，分离腰段脊髓4%多聚甲醛固定12小时，脱水，石蜡包埋，制作成4 μm的组织切片。脊髓石蜡切片经二甲苯和不同梯度的乙醇脱蜡、柠檬酸钠抗原修复液抗原修复、QuickBlockTM免疫染色封闭液封闭1小时、一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜、荧光二抗(1∶1 000)25 ℃孵育1小时、加抗淬灭封片剂封片、倒置荧光显微镜下观察并ImageJ软件分析荧光强度。

1.7 免疫印迹检测

行为学测定结束后，处死大鼠，分离并收集脊髓，RIPA裂解20分钟，12 000×g 4 ℃离心20分钟，上清样本BCA试剂盒测定蛋白浓度，SDS-PAGE分离并转移至PVDF(polyvinylidene flouride)膜，使用QuickBlockTM Western封闭液封闭15分钟，一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，二抗(1∶10 000)25 ℃孵育1小时，ECL(enhanced chemiluminescence)显色并可视化，免疫条带扫描并使用ImageJ软件分析灰度值。

1.8 分子对接

PDB库下载Nrf2蛋白晶体结构(PDB ID:2FLU,),Pubchem数据库下载人参皂苷Rg3结构(Compound CID:9918693), Autodock_vina对接Nrf2和人参皂苷Rg3,PyMOL可视化对接结果。

1.9 统计学分析

所有统计分析均使用SPSS 26.0软件进行。数据以平均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05具有统计学差异。

2、结果

2.1 人参皂苷Rg3缓解大鼠癌痛行为

X-射线结果显示，与假性手术组相比，模型组大鼠胫骨骨组织出现溶骨性损伤(图1A)。骨组织切片染色结果显示，模型组大鼠胫骨骨组织中骨小梁结构中断(图1B)。模型组大鼠机械痛阈值下降，热痛阈值下降，自发痛次数增加。经人参皂苷Rg3处理后，与模型组相比，Rg3给药组大鼠机械痛阈值上升，热痛阈值上升，自发痛次数下降(图1C-E)。

图1 人参皂苷Rg3对癌痛大鼠行为学的影响

2.2 人参皂苷Rg3降低脊髓炎症

与假性手术组相比，模型组大鼠脊髓促炎因子IL-1β、星形胶质细胞标记物GFAP、小胶质细胞标记物Iba1、NLRP3炎症小体成分NLRP3和caspase-1荧光强度均增强，同时表达灰质值上调(图2)。经人参皂苷Rg3处理后，与模型组相比，Rg3给药组大鼠IL-1β、GFAP、Iba1、NLRP3和caspase-1的荧光强度和表达均下调(图2)。

图2 人参皂苷Rg3对脊髓炎症的影响

2.3 人参皂苷Rg3激活Nrf2介导的抗氧化反应

与假性手术组相比，模型组大鼠脊髓抗氧化因子Nrf2及GPX4的荧光强度和表达灰度值均下降，线粒体相关氧化因子DHODH和Cyto C的荧光强度和表达灰度值均上调(图3A-D)。经人参皂苷Rg3处理后，与模型组相比，Rg3给药组大鼠脊髓Nrf2及GPX4的荧光强度和表达灰度值均上调，DHODH和Cyto C的荧光强度和表达灰度值均下降(图3A-D)。分子对接结果显示，人参皂苷Rg3可与Nrf2的418位缬氨酸、465位缬氨酸、470位精氨酸和512位缬氨酸结合(图3E)。

3、讨论

本研究发现人参皂苷Rg3可激活核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)介导的抗氧化及抗炎反应并缓解癌痛。Nrf2激活可增加多种抗氧化蛋白包括NADH醌氧化还原酶、血红素加氧酶1、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶(SOD)等的表达[13]。氧化应激及损伤可诱导炎症反应，包括转录因子、炎症细胞因子、趋化因子等促炎介质，招募炎症细胞，同时刺激伤害感受器并介导疼痛[14]。在不同疼痛神经损伤、化疗诱导神经病变、骨关节炎等模型动物中，Nrf2激活可选择性增加抗氧化基因表达，并逆转慢性疼痛[15]。据报道，人参皂苷Rg3治疗后可激活Nrf2通路，降低丙二醛，增加谷胱甘肽水平，减少ROS积累，抑制促炎介质TNF-α、IL-6和IL-1β,并在急性胰腺炎种发挥保护作用[16]。据此，我们推测人参皂苷Rg3可在缓解癌痛方面发挥作用。

图3 人参皂苷Rg3对脊髓氧化损伤的影响

我们研究发现人参皂苷Rg3可激活Nrf2/过氧化物酶4(GPX4)信号抑制氧化损伤。GPX4作为体内脂质修复酶，是Nrf2的重要转录靶标。Nrf2通过直接或间接调节GPX4含量，从而降低脂质过氧化物水平，减轻氧化损伤[17]。线粒体是过氧化物产生的主要来源，主要来自于呼吸链复合物的电子泄露，介导氧单电子还原为超氧化物。其中二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)位于线粒体内膜，在氧化还原反应中催化二氢乳清酸转化为乳清酸，产生电子，从而与线粒体呼吸链偶联，有助于超氧化物和H2O2产生[18];细胞色素C位于线粒体膜间隙中，在电子传递链中充当电子载体，细胞色素C可为H2O2打开通道，从而增强过氧化物酶活性[19]。研究表明，人参皂苷Rg3可上调线粒体生物发生和抗氧化酶活性，同时增强ATP的合成[20]。在本研究中发现，人参皂苷Rg3可抑制线粒体ROS的产生，从而降低细胞氧化损伤。据此，人参皂苷Rg3可在线粒体介导的氧化应激中发挥重要作用。

在本研究中，我们发现人参皂苷Rg3可调控Nrf2活性，激活抗氧化反应，降低脊髓炎症，从而缓解癌痛。为人参皂苷Rg3在癌痛方面的应用提供数据支持。然而，人参皂苷Rg3与Nrf2结合的分子机理在本文中并未深入研究，在后续实验中可通过体外实验进行验证，从而明确人参皂苷Rg3抗氧化的分子机制。

参考文献:

[5]王煜嘉,张凤,王柏军,等.2-溴棕榈酸鞘内给药对乳腺癌骨转移大鼠疼痛的作用及机制[J].湖北科技学院学报:医学版,2020,34(4):281-284.

基金资助:国家自然科学基金资助项目(编号:81971066);

文章来源:李雅晨,盛格格,吴基良等.人参皂苷Rg3对乳腺癌骨转移大鼠疼痛的缓解作用及机制研究[J].现代肿瘤医学,2024,32(08):1397-1401.