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乳腺癌组织中TIMP-3及DNMT1的表达与患者预后的相关性

2024-08-08 39 上传者：管理员

摘要：目的:分析研究乳腺癌患者中基质金属蛋白酶组织抑制因子3(TIMP-3)及DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达水平与患者临床预后的相关性。方法:收集58例临床资料完整的乳腺癌手术切除标本，采用免疫组化SP法检测癌组织及相应癌旁组织中TIMP-3、DNMT1、ER、PR、HER-2、p53、Ki-67的表达，将TIMP-3、DNMT1表达水平与临床病理参数及随访生存状况进行相关性分析，所有入组患者均进行随访5年以上。结果:我们发现，在乳腺癌组织中，TIMP-3呈低表达，DNMT1呈高表达，TIMP-3及DNMT1的表达呈负相关；TIMP-3表达水平与Ki-67呈负相关，DNMT1表达水平与Ki-67呈正相关，与其他临床病理参数未见相关性。Cox风险比例模型分析显示只有临床分期和DNMT1表达水平是影响总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的独立风险因素。TIMP-3低表达组的5年OS和DFS均显著低于高表达组，DNMT1高表达组的5年OS和DFS均显著低于低表达组。结论:研究表明乳腺癌中TIMP-3及DNMT1表达水平与肿瘤细胞恶性表型及患者生存时间有关，可能成为判断乳腺癌预后的一项重要指标，并作为治疗计划制定的依据。

关键词：
DNA甲基转移酶1
乳腺癌
基质金属蛋白酶组织抑制因子3
总生存期
无病生存期
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乳腺癌目前是人类发病率较高的癌种[1]。乳腺癌治愈的关键是改变其易转移的生物学行为。与这一生物学行为相关的基因非常多，其中金属基质转移酶相关基因(matrix metalloproteinases, MMP)具有举足轻重的作用[2]。随着研究工作的推进，人们发现，每一种MMP都有着和它对应的基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase, TIMP)[3]。TIMP-3作为TIMP家族中一个重要的成员，其作用特点在乳腺癌的发病机制中研究的较少。TIMP-3能够抑制MMP在癌细胞中的活性，从而发挥抑癌基因作用[4]。而TIMP-3基因由于其自身的甲基化而引起的基因表达沉默可能在肿瘤的侵袭转移中发挥着独特的作用[5-6]。而在这一过程中，DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, DNMT)活性的增加，会抑制基因表达[7]。研究人员在真核生物中发现了3类DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b)。DNMT1是维持甲基化酶，具有促甲基化并维持甲基化稳定的作用，在癌细胞的生物学过程中具有重要作用[8-9]。那么，在乳腺癌中，TIMP-3和DNMT1有何相关性，及其与患者预后的关系尚不清楚。本课题组就这一问题在原发性乳腺癌患者肿瘤组织中TIMP-3和DNMT1表达水平与患者总生存期(overall survival, OS)、无病生存期(disease free survival, DFS)等预后指标以及雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)等其他病理学指标的关系进行了研究。

1、材料与方法

1.1实验设计

课题组选择2015年西安医学院第二附属医院及陕西省人民医院确诊的乳腺癌患者蜡块标本。入选标准：乳腺癌手术(浸润性癌和/或导管原位癌)年龄≥18岁到≤85岁，计划在乳房单纯切除术伴或不伴腋窝前哨淋巴结活检，医院批准签署知情同意书。排除标准：(1)患者存在任何身体或精神状态异常而影响目的与结果评估和随访；(2)计划开始前30天内，患者服用一种试验性药物或使用一个试验性医疗设备治疗；(3)不遵守或不能完成实验及跟进随访者。观察指标：主要观察指标为OS;次要观察指标为DFS。所有患者均进行了改良根治术或同等水平的手术治疗，手术均由副高级以上医师进行。所有石蜡标本均包含癌组织及癌旁组织，均经免疫组化检测TIMP-3、DNMT1、ER、PR、HER-2、Ki-67等指标，所有患者均进行定期随访至5年，统计OS及DFS数据并记录。

1.2免疫组化

石蜡包埋乳腺癌组织及癌旁组织标本制成4μm连续切片，常规脱蜡水化，采用SP法检测TIMP-3、DNMT1、ER、PR、HER-2、Ki-67在乳腺癌及癌旁组织中的表达。鼠抗人TIMP-3单克隆抗体、鼠抗人DNMT1单克隆抗体、鼠抗人ER单克隆抗体、兔抗人PR多克隆抗体、鼠抗人Ki-67单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司，兔抗人HER-2多克隆抗体购自英国Abcam公司；通用型SP免疫组化试剂盒(SP-9000)购自北京中杉金桥公司。免疫组化染色步骤参照试剂盒说明书进行，HER-2一抗稀释度为1∶100,TIMP-3、DNMT1、PR、Ki-67一抗稀释度为1∶200,ER一抗稀释度为1∶400,以PBS液代替一抗作为阴性对照。

1.3结果判定

TIMP-3和DNMT1免疫组化结果判定参照已发表文章的方法进行[10-11]。阳性细胞计分标准为：<5%为0分、6%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、>75%为4分，染色强度分级计分标准为：无显色为0分、淡黄色为1分、黄或深黄色为2分、褐或棕褐色为3分，两者计分的乘积作为最后评分；研究中TIMP-3和DNMT1表达中位评分为8分，因此将评分≤8分定义为低表达，评分≥9分定义为高表达。ER、PR采用Allred评分，≥2分为阳性；HER-2采用FDA评分，≥3分为阳性；Ki-67核标记指数≥15%为高表达。

1.4随访

随访截止于2021年12月30日，随访时间12～70个月，中位随访时间59个月。58例患者中失访2例(2例均为通讯地址失效)。生存时间自完成手术日起计算，OS计算以患者死于乳腺癌相关并发症为终点事件，DFS计算以肿瘤复发为终点事件，肿瘤复发时间依据明确的临床表现或影像学检查结果确定。

1.5统计分析

所有涉及实验均至少重复3次，不同的实验人员确认后进行一致性评价，免疫组化评分取平均数进行结果判定和计数统计。采用SPSS 22.0统计分析软件进行，组间比较采用χ2检验，采用Kaplan-Meier生存曲线分析分析生存率，TIMP-3和DNMT1之间的相关性采用Spearman相关分析，采用Cox比例风险回归模型进行多因素分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1患者基线特征及TIMP-3、DNMT1表达情况

本研究共入组58例患者，患者中有2例男性，其余均为女性，年龄29～70岁，中位年龄48岁。淋巴结转移：无淋巴结转移者25例，伴淋巴结转移者33例，其中Nl期(1～3枚淋巴结转移)23例，N2期(4～9枚淋巴结转移)10例；手术方式：单纯切除及前哨淋巴结活检术20例，保乳手术5例，改良根治术33例；所有患者均接受了术后辅助治疗，其中化疗40例，放疗16例，内分泌治疗42例，靶向治疗18例。我们对入组患者基线资料进行了统计发现，Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌占比84.48%,三阴性乳腺癌11例，占比18.96%,所有患者初治时均为可手术患者，均进行了相应手术治疗。各病理亚组中，我们分别进行了TIMP-3、DNMT1表达情况的检测和统计，见表1。

表1患者病理学参数与TIMP-3、DNMT1表达情况n(%)

2.2 TIMP-3及DNMT1的表达情况及其相关性

在乳腺癌组织中，TIMP-3表达于肿瘤细胞质中，呈棕黄色颗粒；DNMT1表达于肿瘤细胞核内，呈棕黄色颗粒(图1)。其中，TIMP-3低表达46例(79.31%)、高表达12例(20.67%);DNMT1低表达13例(22.41%)、高表达45例(77.58%)。本研究发现，乳腺癌组织中TIMP-3呈低表达，DNMT1呈高表达，TIMP-3及DNMT1的表达呈负相关。具体相关性见表2。

2.3 TIMP-3及DNMT1的表达与病理学指标的关系

乳腺癌组织中，TIMP-3表达水平与Ki-67呈负相关，DNMT1表达水平与Ki-67呈正相关，与其他临床病理参数未见相关性(表3-4)。

图1乳腺癌组织中TIMP-3及DNMT1的表达情况(IHC×100)

表2 TIMP-3与DNMT1的表达相关性

表3 TIMP-3的表达与Ki-67相关性

表4 DNMT1的表达与Ki-67相关性

2.4 TIMP-3及DNMT1的表达与患者预后的关系

Cox比例风险回归模型分析显示只有临床分期和DNMT1表达水平是影响总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的独立风险因素(表5-6)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，TIMP-3低表达组的5年OS和DFS均显著低于高表达组、DNMT1高表达组的5年OS和DFS均显著低于低表达组，差异具有统计学意义，见图2。

表5 OS多变量Cox比例风险回归模型分析结果

表6 DFS多变量Cox比例风险回归模型分析结果

图2 TIMP-3的表达与乳腺癌患者预后的关系

3、讨论

乳腺癌有别于良性疾病的本质在于乳腺癌细胞具有自我更新及浸润转移的能力。转移是大多数癌症患者死亡的根本原因，其机制仍不清楚。恶性肿瘤浸润和转移的基本阶段包括肿瘤细胞从细胞外基质脱离、周围组织和基板的浸润、血管内渗血、存活和通过血流的运输、远端迁移、阻滞和外渗以及转移灶的形成[12]。肿瘤-间质界面是肿瘤细胞以单细胞或集体迁移的方式侵袭的地方，其中，肿瘤细胞对细胞外基质的降解是其发生转移的关键步骤之一[13]。那么TIMP-3作为其中的重要基因，其作用越来越受到人们的重视。目前，TIMP-3被认为是抑制肿瘤生长、侵袭和血管生成的抑癌基因，TIMP-3常在脑膜瘤、胶质母细胞瘤、胰腺内分泌癌、宫颈癌或肺癌中被发现呈低表达状态[14-16]。另外，已有研究表明TIMP-3表达的降低与乳腺癌患者的预后不良有关[17]。这一点正与我们的研究结果一致。

而造成TIMP-3低表达的原因之一是由于其自身的甲基化而引起的基因表达沉默失活[18-19]。而DNMT1恰好具有促甲基化并维持甲基化稳定的作用。我们研究发现二者具有相关性。也有研究发现，高表达的环状RNA circ-DNMT1可以结合和调控乳腺癌细胞的致癌蛋白[20-21]。表观遗传学调控的改变，包括DNMT1的DNA高甲基化，已被认为是三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤发生的原因之一。DNMT1的表达与乳腺癌的低生存率相关，且在TNBC亚型中过表达。DNMT1在TNBC中的致癌作用包括：抑制雌激素受体(ER)表达；促进转移所需的上皮-间充质转化(EMT);诱导细胞自噬；促进TNBC中肿瘤干细胞的生长。DNMT1抑制剂对TNBC细胞具有抗肿瘤作用，可能使TNBC患者对免疫检查点抑制治疗敏感。DNMT1是破坏TNBC细胞以及破坏其转移性和侵袭性表型的表观遗传靶点[22]。

从我们的试验数据中，可以看出临床分期较晚、复发风险较高的乳腺癌患者，TIMP-3普遍呈低表达，而DNMT1普遍呈高表达，二者有一定的相关性。也就是说，TIMP-3低表达和DNMT1高表达的患者预后差。这也进一步揭示了TIMP-3作为抑癌基因，在癌症发展的过程中普遍被抑制，而DNMT1的高表达有可能是造成这一现象的原因之一，但其具体机制还有待进一步研究。我们都知道，在基因表达的过程中，miRNA是广泛参与其中的，因之具有抑制靶基因转录、翻译或者能够剪切靶mRNA并促进其降解的功能，miRNA被认为在调控发育过程中有重要作用。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过碱基配对调控基因表达。有研究者在乳腺癌中发现，miR-101可通过抑制DNMT3a进而恢复E-cadherin表达来实现抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力[23]。所以是否有哪一种miRNA参与调控TIMP-3和DNMT1间的表达不得而知。我们课题组将就此问题在将来的工作中进一步展开研究，以期揭示其具体机制。

病理指标中，Ki-67是一种核蛋白质由MKI-67基因编码，又称之为MKI-67,在病理免疫组化中经常用到，提示细胞的增殖活跃程度，Ki-67低表达的浸润性乳腺癌患者预后较好[24]。我们的研究表明，TIMP-3表达水平与Ki-67呈负相关，DNMT1表达水平与Ki-67呈正相关，说明TIMP-3低表达及DNMT1高表达的患者预后差。这与我们进一步的随访结果一致，提示我们检测TIMP-3及DNMT1表达水平可作为预测患者预后的指标。

综上所述，我们得出乳腺癌中TIMP-3及DNMT1表达水平与肿瘤细胞病理表型及患者预后有着一定的关系，可能成为判断乳腺癌预后的一项重要指标，并作为治疗计划制定的依据之一。日后有可能成为常规检测项目出现在病理报告上，并期望看到相关的靶向药物的诞生。

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基金资助:陕西省重点研发计划(编号:2023-YBSF-329);陕西省人民医院科技发展孵化基金(编号:2022YJY-01);陕西省人民医院科技人才支持计划菁英人才项目(编号:2022JY-08);西安医学院第二附属医院博士基金(编号:X2Y-R9);

文章来源:于娇,李汉杰,陈鑫,等.乳腺癌组织中TIMP-3及DNMT1的表达与患者预后的相关性[J].现代肿瘤医学,2024,32(17):3248-3253.