交通、建筑业、工农业机械化的快速发展，以及自然灾害、医源性损伤等原因，使得周围神经损伤的发病率逐年上升。上述损伤原因中，交通事故导致的周围神经损伤约占46%，其中55岁以下患者约为83%[1]。近年来中国周围神经损伤的发病率虽呈现下降趋势，但仍为美国的8.2倍[2]。医源性损伤多以过度牵拉、压迫性损伤、术中直接损伤等原因多见[3,4,5]。损伤后周围神经仍旧保留内源性再生能力，以背根神经节轴突再生为主[6]，因此精准高效的轴突标记显得尤为重要。背根神经节电穿孔技术就是一种标记周围神经轴突的方法，据文献报道电穿孔时脉冲频率和电压的高低会影响电穿孔效率，脉冲频率过高会导致细胞死亡[7]。为此，作者拟通过改变电压的方式，探究电压高低与转染效率之间的关系，以此来提高对神经元及其轴突的标记率，从而增加背根神经节电穿孔技术在神经再生领域的应用性。作者前期预实验结果表明，在90V电压下电穿孔后出现背根神经节组织电灼伤，组织破损较严重，故而选择了35V与90V中间的电压，即60V进行实验。该实验使用35V和60V两种电压，在体内对背根神经节进行电穿孔，通过坐骨神经夹伤模型对优化的电穿孔条件进行验证。

1、材料和方法

1.1设计

优化电压水平，对比观察动物实验。

1.2时间及地点

2019年3至9月在苏州大学骨科研究所完成。

1.3材料

1.3.1质粒

实验使用的EGFP质粒(载体为pEx-4，购买于上海吉玛生物有限公司)通过试剂盒(天根)进行提取，提取完成后可见白色DNA沉淀附着于1.5mL离心管管底，然后对质粒进行浓缩，无菌水将提取的质粒DNA溶解成质量浓度为2.0-3.0g/L的悬浮液。

1.3.2显微注射器

通过微拔管器(NARISHIGE仪，PC-10型)在58℃下将10cm的毛细玻璃管拉伸，拉成70μm直径的微量注射针。

1.3.3药品和试剂

生理盐水、二水合磷酸氢二钠、十二水合磷酸二氢钠、氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)；多聚甲醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；蔗糖(上海源叶生物科技有限公司)；OCT冷冻切片包埋剂(北京雅安达生物技术有限公司)。

1.3.4实验动物

8-10周龄ICR小鼠32只，雌雄各半，体质量20-40g，饲养于苏州大学SPF级动物房内。所有涉及动物的实验均通过苏州大学实验动物伦理委员会备案。

1.4方法

1.4.1活体电穿孔

随机选取16只ICR小鼠，随机分配到35V组和60V组，每组8只，其中35V组有4只雌鼠，4只雄鼠；65V组有3只雌鼠，5只雄鼠。给予上述16只ICR小鼠腹腔注射10mg/kg噻拉嗪和100mg/kg盐酸氯胺酮混合溶液进行麻醉。消毒后，小鼠下背部中线位置切开3cm长切口，剥离L4和L5棘突上的肌肉；在脊柱两侧行背外侧椎板切除术，充分暴露L4和L5的背根神经节；用显微注射针吸取质量浓度为2.0-3.0g/L的EGFP质粒，通过二氧化碳压力泵对充分暴露的背根神经节进行显微外科注射，注射速度为1µL/min；待背根神经节注射完全后，使用特制铂金金属镊子电极[设置正负极之间的距离为(1.2±0.2)mm]和BTXECM830电转仪对背根神经节进行电流刺激(条件为35V/60V电压，15ms脉冲，950ms间歇，5次[8,9])，电穿孔后逐层缝合，于37℃加热垫上保温等待动物苏醒。为保持实验的严谨性和精确性，手术皆由同一人完成。另随机取8只小鼠不进行任何处理作为对照组，剩余8只小鼠注射EGFP质粒但未行电穿孔。

1.4.2周围神经损伤

对上述2组电穿孔术后第2天的ICR小鼠进行深度麻醉，剃除股骨及其周围的毛发，手术区域进行消毒处理。小鼠侧卧于手术台，充分暴露出坐骨神经，仔细用镊子钝性游离坐骨神经与其周围组织；11-0缝合线在游离神经外膜处缝合并打结，左手持镊子轻轻挑起游离的坐骨神经，右手使用5号镊子在标记处夹闭10s，此后松开镊子，可在夹伤处清楚看到损伤的夹痕且神经外膜完整连续(未发生神经离断)；术后无菌生理盐水冲洗伤口，逐层缝合。

1.4.3取材、固定

对上述周围神经损伤后第2天的ICR小鼠进行麻醉，充分暴露心脏，静脉输液针穿刺左心室，并固定针尖，在右心耳的位置刺出一个针尖大小的孔道，缓慢向左心室内注射磷酸盐缓冲液，将小鼠体内的血液充分冲出(这个过程需要持续大约10min)，小鼠肝脏呈现白色时换40g/L多聚甲醛溶液继续向左心室灌注(此过程需持续大约20min)，小鼠呈现僵直状态，去除皮肤及内脏等组织，使用咬骨钳咬除L4-5椎体并暴露出背根神经节，取出电穿孔转染的背根神经节组织；剥离周围神经损伤侧的肌肉组织，显露出坐骨神经，使用显微外科剪完整取出坐骨神经。将取出的组织置于40g/L多聚甲醛溶液4℃浸泡保存。

1.4.4背根神经节冰冻切片

取出40g/L多聚甲醛溶液4℃浸泡保存的电穿孔背根神经节进行20%-30%梯度蔗糖脱水，使用OCT冷冻切片包埋剂包埋组织，行背根神经节冰冻切片(切片厚度为12μm)，切片置于室内避光1h，然后置于-20℃避光保存。

1.4.5苏木精-伊红染色

将背根神经节切片置于室温避光放置1h后，于磷酸盐缓冲液中摇床缓慢摇晃3次，每次10min，洗除切片上的OCT包埋剂，此后进行苏木精-伊红染色。

1.4.6压片

取出40g/L多聚甲醛溶液4℃浸泡保存的坐骨神经及背根神经节组织，在无菌磷酸盐缓冲液中小心仔细地剥除附着的肌肉神经筋膜等。将组织以其固有的形态摆放于载玻片上(为避免组织干涩，可以滴加适量的磷酸盐缓冲液)，滴加防荧光淬灭剂，盖上盖玻片(避免有气泡的产生)，将处理好的玻片置于20kg下压2h，待组织平铺展开(此过程需避光操作)，-20℃下避光保存玻片。压片组织置于荧光显微镜下观察以及计数被EGFP转染标记的神经元轴突。

1.4.7轴突数量统计

背根神经节电穿孔转染EGFP质粒后，在神经元内部及其轴突表达绿色荧光蛋白，使用ImageJ软件，对每一根表达荧光的轴突进行计数统计。同样分别对周围神经损伤部位前和通过损伤部位且表达荧光蛋白的轴突进行计数统计。

1.4.8后肢运动功能评分[10]

电穿孔后第2天对实验鼠进行BMS评分，评估背根神经节电穿孔对小鼠行为的影响。先让小鼠在测试环境中活动适应30min，随后对其进行评分测试，见表1。

表1后肢运动功能BMS评分

表1后肢运动功能BMS评分

1.5主要观察指标

电穿孔转染EGFP质粒后，被转染的背根神经节神经元及其轴突表达荧光蛋白，统计荧光标记的神经轴突数量。

1.6统计学分析

所有数据均使用Prime软件进行统计学分析，以表示。统计时使用t检验以明确各组之间的统计学差异，P<0.05为差异有显著性意义，P<0.01为差异有非常显著性意义。

2、结果Results

2.1实验动物数量分析

32只ICR小鼠，最终数据均进入结果分析，术中及术后无脱落。

2.2EGFP质粒成功传递进入活体背根神经节内

用35V/60V电压，15ms脉冲，950ms间歇，5次的转染条件对小鼠背根神经节进行电穿孔转染。首先进行背根神经节(L4/5)的暴露手术，并将EGFP质粒注射进入背根神经节内，见图1A,B，然后用特制的铂金镊子电极对背根神经节进行电穿孔转染，电穿孔后背根神经节的形态未发生明显改变，见图1C。至今为止，电穿孔实验的存活率接近100%(实验数量已达16只)，术后观察小鼠运动及使用镊子刺激小鼠后肢引起的疼痛反射均未出现明显异常。

2.3提高电穿孔电压对背根神经节神经元无明显的致死率

对照组、注射EGFP质粒但未行电穿孔组、35V电穿孔组、60V电穿孔组均未出现明显的可见异常，见图2。单独注射EGFP质粒的背根神经节神经元与对照组无明显差异，表明EGFP质粒并不会对细胞造成损伤；35V及60V电穿孔组与对照组背根神经节神经元相比细胞形态无明显异常，表明在35V及60V电压条件下的电穿孔对神经元未造成明显的损害，也不会导致神经元死亡。

2.4提高电穿孔电压可增加背根神经节标记率

在背根神经节中可以清楚检测到EGFP标记的神经元胞体，见图3。此外，来自神经节的背根中央轴突也被EGFP所标记，见图3。针对标记的背根神经节神经元轴突进行统计，结果显示60V条件下标记的轴突数显著多于35V，差异有显著性意义(P<0.01)。

2.5BMS评分未发现电穿孔后小鼠行为异常

术后第2天对小鼠进行BMS评分，35V、60V组与正常对照组相比，评分未出现明显降低，差异无显著性意义，表明60V电压下的背根神经节电穿孔不会影响小鼠行为学的改变，见图4。

2.6提高电穿孔电压可增加损伤部位前后的神经元轴突标记率

与35V组相比，60V组损伤部位之前和损伤部位之后的轴突数均明显增多，差异有显著性意义(P<0.01,P<0.05)，见图5。

3、讨论

周围神经损伤多以轴突病变为主，神经元作为机体内一种不可增殖的永久细胞，其轴突本身的再生能力有限。神经元轴突的再生有以下影响因素：第一，周围的抑制性外环境[11]；第二，自身再生能力弱[12]。周围神经损伤后虽保留内源性再生能力，但功能恢复不全[13,14]。为此需要标记更多的轴突以便观察与统计再生的轴突。转基因技术和病毒载体的应用使得轴突再生的研究得以发展[15,16,17]。在中枢神经系统模型中，利用病毒转染脑皮质神经元，再通过顺行示踪剂生物素化葡聚糖胺二次注射标记再生轴突[18,19]。在周围神经系统中，再生轴突可通过霍乱毒素B(choleratoxinB,CTB)对坐骨神经进行逆行标记[20]。但这2种方法均需要一定时间转染以及后期繁琐复杂的切片和染色。此外，研究者对病毒基因的纯化可实现精准的时空控制，但却不能对感兴趣的基因进行人为操作[21]。病毒进入细胞需要载体的帮助，这些载体可以激活宿主的免疫防御系统，此时可能会对实验结果产生不利的影响。

电穿孔技术一定程度上克服了上述不足，电穿孔转染是指细胞在电压及短时脉冲形成的场强作用下，在细胞膜上出现瞬时疏水性孔洞，使得研究物质(如亲水性分子、DNA、蛋白质、病毒、siRNA、药物等正常不能通过细胞膜的物质)导入细胞[22]。目前电穿孔在医学等领域实现了多方面的应用，研究者将目的基因、药物等电穿孔进入肿瘤细胞，从而抑制肿瘤的生长[23,24,25]。在大脑的发育时期，子宫内电穿孔技术已经应用于胚胎时期大脑皮质神经细胞的活体转染。最近的研究表明体内背根神经节电穿孔能够成功转染成年的感觉神经元[21,26]。在周围神经损伤的再生研究中，可通过转染siRNA或DNA，以此来调控基因对周围神经再生的作用[27,28]，但转染背根神经节神经元的细胞数量及轴突数量较少，尤其是损伤部位之后的轴突数量更少，这使得在进行周围神经再生统计时出现较大误差，故高效的再生轴突标记可在一定程度上减小此种误差。

细胞膜发生穿孔的程度取决于细胞膜承受电场强度的大小，当外加场强小于细胞膜可逆性电穿孔场强时，细胞膜可恢复正常形态与生理功能；当外加场强超过可逆性电穿孔场强时，细胞则出现不可逆性电穿孔，最终导致组织细胞坏死[29]。文献报道，电穿孔脉冲频率和电压高低会影响电穿孔效率，电压及脉冲频率过高会导致细胞死亡[7]。既往的研究表明，肿瘤细胞的直接死亡原因是细胞膜不可逆性亲水通道的形成，细胞外基质及其他分子大量涌入细胞，导致肿瘤细胞发生一种即刻破坏效应，细胞崩解坏死[30]。目前，不可逆性电穿孔已被应用于临床的肿瘤消融，通过改变电压及脉冲频率来促使肿瘤细胞坏死，但不可逆性电穿孔的适应范围仍不明确[31]。随着电压、脉冲频率及时间的增加，电穿孔过程中会产生更多的热量，这些热量对组织及细胞造成热损伤，降低细胞存活率[32]。作者前期预实验发现在90V电压下，背根神经节组织出现电灼伤表象，这就说明在更高的电压下会产生更多的热量损伤组织及细胞，故该实验选择35V与90V之间的中间值(60V)进行研究。因此，适当提高电压便成为一个有效标记轴突的办法。

以往的电穿孔多针对细胞进行研究，该实验对已建立的成年感觉神经元在体内电穿孔电压条件进行优化，通过提高电压增加神经元及其轴突的标记效率，从而标记更多的神经元及神经轴突，为研究轴突的再生提供了有力的依据。首先，通过在60V的条件下将EGFP质粒导入到同一动物的不同背根神经节中，可以发现被标记的轴突。由于是体内实验，因此消除了体外多方面因素的差异，保证了实验的严谨性及准确性；其次，通过提高电压，该研究表明在60V的电压下并未对细胞造成损伤；第三，电穿孔数小时后就开始表达转染的基因，相比传统的转基因诱导和病毒基因转导，这就实现了精准的时间与空间控制；第四，使用EGFP质粒的电穿孔避免了后期繁琐的染色，也避免了染色过程中发生标记错误[33]。但是该研究存在一定的缺陷，电穿孔时转染的细胞并不全是神经元，还包括许旺细胞等非神经元细胞，这可能影响对实验结果的解释，但不影响对轴突的研究[34]。此外，该技术可在一两个小时内完成手术，避免了对实验动物的损伤，更有利于其康复，结果也显示出背根神经节电穿孔术后小鼠行为学并未出现明显的改变，也不会影响其肢体的功能，避免了因神经损伤后出现肢体的坏死及失用性萎缩。此项技术仍有很大的发展空间，手术伤口较大、手术时间较长等都是可以改进的方向。此外电穿孔转染的效率较转基因方法或病毒介导的基因传递偏低，但通过提高电压可以使其转染效率较之前有所提高。

综上所述，将背根神经节电穿孔的电压改变为60V后，标记的周围神经轴突数明显增多，为后期使用此技术的研究者奠定了研究周围神经轴突再生的基础。

图1成年小鼠背根神经节神经元体内电穿孔实验

图注：图中A为脊柱一侧手术暴露的L4/5背根神经节图像(蓝色箭头)；B为经手术暴露的背根神经节图像，注入质粒DNA和快绿染料的混合物(蓝色箭头)；C为活体电穿孔术后背根神经节(蓝色箭头)；D为研究中所用电极

图2背根神经节神经元电穿孔对细胞无明显致死率(苏木精-伊红染色，标尺为200μm)

图注：图中A为对照组的小鼠背根神经节；B为注射EGFP质粒但未行电穿孔组的小鼠背根神经节；C为35V电压时电穿孔的小鼠背根神经节；D为60V电压时电穿孔的小鼠背根神经节

图3电压增高能够提高神经元标记效率

图注：图中A为电穿孔电压为35V时，背根神经节神经元及其轴突标记(标尺为400μm);B为电穿孔电压为60V时，背根神经节神经元及其轴突标记；C为35V组(n=8)与60V组(n=8)被标记背根神经节神经元轴突数量统计

图4电穿孔未造成小鼠后肢功能的行为异常

图5提高电压可以增加神经元轴突在损伤部位前后的标记率

图注：图中A为电穿孔手术及外周神经损伤模式图；B,C分别为35,60V电压条件下，坐骨神经轴突标记(标尺为500μm);D为损伤部位之前，35V(n=8)与60V(n=8)电压下周围神经轴突标记数目统计；E为损伤部位之后，35V(n=8)与60V(n=8)电压下周围神经轴突标记数目统计

参考文献:

[2]陈明伟,袁晓华,潘敏,等.从道路交通事故统计分析对比谈预防措施[J].中国安全科学学报,2004,14(8):59-63.

[3]韦正超,蔡道章,徐柜如,等.医源性外周神经损伤临床治疗分析[J].中华显微外科杂志,2002,25(2):152-153.

[4]李志杰,高伟阳,廖孔荣,等.医源性周围神经损伤及显微外科治疗[J].温州医学院学报,2002,32(2):115-116.

[5]张国亮,蔡启卿,冯明录.医源性周围神经损伤的治疗[J].中国矫形外科杂志,2000,7(5):503.

[29]刘颖,周玮,熊正爱,等.不可逆性电穿孔致山羊肝脏组织凋亡与坏死的实验研究[J].解放军医学杂志,2011,36(4):356-360.

[30]姚陈果,孙才新,米彦,等.陡脉冲对恶性肿瘤细胞不可逆性电击穿的实验研究[J].中国生物医学工程学报,2004,23(1):92-97.

[31]梁冰,牛立志,曾健滢,等.不可逆电穿孔消融兔胆囊侧肝脏病理学观察[J].介入放射学杂志,2014,23(4):320-324.

[32]俞允.基于电穿孔技术的活细胞表面增强拉曼光谱研究[D].福州:福建师范大学,2011.

齐士斌,马艳霞,张浩楠,马进进,徐金辉,赛吉拉夫.背根神经节电穿孔转染神经元技术的改进[J].中国组织工程研究,2020,24(19):3042-3047.

基金:国家自然科学基金(81772353,81571189),项目负责人:赛吉拉夫.