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单宁酸通过抑制铁死亡改善小鼠肾脏缺血-再灌注损伤

2024-11-14 138 上传者：管理员

摘要：目的探索单宁酸在小鼠肾脏缺血-再灌注损伤（IRI）中的作用及机制。方法雄性C57BL/6J小鼠随机分为假手术组（Sham组）、空白对照组（Sham+TA组）、实验组（IRI组）和治疗组（IRI+TA组），每组20只。观察肾脏IRI术后48 h小鼠生存情况。IRI 24 h后留取小鼠血清和肾组织标本（每组各5只），检测小鼠血尿素氮与血清肌酐水平。检测肾组织炎症因子及铁死亡相关指标水平；评估肾脏组织病理损伤。检测肾组织谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、酰基辅酶A合成酶长链家族4(ACSL4)蛋白表达水平。使用分子对接软件探究单宁酸与核因子E2相关因子2(Nrf2)结合活性，并验证Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)表达。结果与IRI组相比，IRI+TA组小鼠术后生存率较高（0比60%），血清肌酐、血尿素氮水平下降，肾组织白细胞介素（IL）-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α水平下降，肾组织损伤改善，肾组织丙二醛、亚铁离子水平降低，谷胱甘肽水平升高，GPX4表达增多，ACSL4表达减少（均为P<0.05）。单宁酸可与Nrf2形成合适的空间互补，其结合能为-8.7 kcal/mol，单宁酸与Nrf2具有较强的结合能力。IRI+TA组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1蛋白水平上调。结论单宁酸可能与Nrf2蛋白结合，激活Nrf2/HO-1通路抑制铁死亡，改善小鼠肾脏IRI。

关键词：
IRI
单宁酸
缺血-再灌注损伤
肾移植
铁死亡
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肾缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI）常见于肾移植术后，也是导致急性肾损伤（acute kidney injury,AKI）的主要原因之一[1]。尽管新型免疫抑制药、缩短冷热缺血时间等治疗策略已成功应用于临床，但肾移植仍然面临着众多严峻挑战，其中移植肾功能延迟恢复、急慢性排斥反应、移植肾存活较短等问题严重影响肾移植受者预后，与IRI密切相关[2]。IRI病理生理机制十分复杂，与氧化自由基生成增加、细胞因子风暴、细胞内钙超载等机制密切相关[3-6]，但其机制目前尚未阐明，仍然缺乏有效治疗靶点与药物。

铁死亡是一种细胞死亡方式，其发生发展与脂质过氧化、铁代谢紊乱、炎症损伤密切相关[7-8]。近年来研究发现铁死亡在IRI中发挥着至关重要的作用，抑制铁死亡发生，可有效减轻肾、心、脑、肠、肝IRI[9-11]。针对铁死亡这一治疗靶点，研究者们发现人尿液干细胞及右美托咪定、纳米硒、克唑替尼等药物可通过抑制细胞铁死亡，显著改善肾IRI[12-14]。因此，以细胞铁死亡作为潜在治疗靶点，对于防治IRI临床意义重大。单宁酸是一种天然多酚类化合物，广泛存在于木质植物、绿茶、咖啡，以及葡萄等新鲜水果中，其结构十分复杂，含有多个酚羟基，可有效清除机体产生的自由基，具有强效抗氧化应激的作用[15]。随着研究深入，研究者们还发现单宁酸具有抗炎、抗抑郁、抗肿瘤、抗病原微生物等多种药理作用[15-17]。本研究通过构建IRI小鼠模型，探索单宁酸在IRI中作用，并结合分子对接的方法探索其具体作用机制，为IRI寻找潜在治疗药物。

1、材料与方法

1.1 实验材料

雄性C57BL/6J小鼠，7～8周龄，体质量20～22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠饲养于中南大学实验动物学部，饲养于无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级环境中，维持合适的饲养温度（20～26℃）、湿度（40%～70%）、光照（光照12 h、黑暗12 h，保持昼夜节律），给予小鼠充足的食物与饮水。动物实验方案均经过中南大学湘雅医院实验动物伦理委员会批准（批准号：2023020225）。

血尿素氮、血清肌酐检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。检测白细胞介素（interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF)-α的酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune absorbent assay,ELISA）试剂盒购自联科生物公司。丙二醛、谷胱甘肽试剂盒购自碧云天生物公司，亚铁离子检测试剂盒采购自北京索莱宝科技有限公司。谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4）、酰基辅酶A合成酶长链家族4(acyl-CoA synthetase long-chain family 4,ACSL4）、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2）、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1）、β-actin抗体购自美国Proteintech公司。单宁酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 实验分组与模型构建

将80只雄性C57BL/6J小鼠完全随机分为假手术组（Sham组）、单纯药物干预组（Sham+TA组）、实验组（IRI组）和治疗组（IRI+TA组），每组20只。Sham+TA组与IRI+TA组术前腹腔注射单宁酸（50 mg/kg），其余两组在相同时间点腹腔注射等体积生理盐水。

使用氯胺酮（50 mg/kg）与甲苯噻嗪（10 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠后，放置于恒温加热板上[体温维持在（36.0±0.5）℃]，碘酒消毒小鼠术区皮肤，腹部正中切口，切除右侧肾脏，无损伤血管夹夹闭左侧肾蒂，左侧肾脏由鲜红色变为暗紫色视为有效缺血，持续夹闭25 min后，松开血管夹，恢复肾脏灌流，肾脏由暗紫色逐渐变为鲜红色，缝合腹部切口，构建IRI模型。假手术组分离双侧肾蒂，并且切除右侧肾脏，不夹闭左侧肾蒂。

处理24 h后，每组5只取血清和肾组织进行后续处理，10只观察生存率，观察截止时间为术后48 h。

1.3 研究内容

1.3.1 肾功能检测

小鼠IRI后24 h，麻醉后腹主动脉取血，留取血清，使用试剂盒检测血尿素氮、血清肌酐水平。

1.3.2 炎症因子及铁死亡相关因子检测

取等量肾脏组织匀浆后，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-6、IL-1β、TNF-α水平，用试剂盒检测丙二醛、谷胱甘肽、亚铁离子水平。

1.3.3 肾脏组织病理学评估

左肾使用多聚甲醛固定后进行包埋，4μm切片后进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin,HE）染色，光镜下进行观察，评估肾脏病理损伤情况。肾脏损伤评估采用Paller评分[18]：肾小管上皮细胞扁平（1分）；刷状缘损伤、消失（1分）；细胞膜出现肿胀空泡（1分或2分）；间质水肿（1分）；细胞质空泡化（1分）；细胞坏死（1分或2分）；肾小管管腔出现脱落或者坏死细胞阻塞，管型出现（1分或2分）。

1.3.4 蛋白表达检测

肾脏组织匀浆后提取总蛋白以及核蛋白，电泳后转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h后GPX4(1∶1 000）、Nrf2(1∶500）、HO-1(1∶1 000）、β-actin(1∶2 000）、ACSL4(1∶1 000）一抗4℃孵育过夜，后二抗室温孵育1 h，化学发光试剂孵育后显像。

1.3.5 分子对接

使用Autodock Vina(1.1.2）软件与LeDock软件进行分子对接，探索单宁酸与Nrf2蛋白结合活性。小鼠源Nrf2蛋白（ID:Q60795）分子结构下载自Uniprot网上数据库（https://www.uniprot.org/）。药物单宁酸（PubChem CID:16129778）化学结构从Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载。分子对接结果使用Pymol软件（2.5.4）进行可视化，Discovery studio visualization2021软件分析单宁酸与Nrf2蛋白的相互作用，并展示单宁酸与Nrf2蛋白的2D相互作用图。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，两组间计量资料比较采用独立样本t检验，多组间计量资料比较采用单因素方差分析。使用Kaplan-Meier曲线进行生存分析，log-rank检验比较生存率差异。P<0.05差异有统计学意义。

2、结果

2.1 单宁酸降低肾IRI小鼠病死率

术后48 h,IRI组小鼠全部死亡，IRI+TA组小鼠生存率为60%。与IRI组比较，IRI+TA组小鼠术后生存率升高（P=0.022，图1）。

2.2 单宁酸改善肾IRI小鼠肾功能

与Sham组比较，IRI组血清肌酐与血尿素氮水平升高；与IRI组比较，IRI+TA组血清肌酐、血尿素氮水平降低（均为P<0.05，图2）。Sham组与Sham+TA组血清肌酐与血尿素氮比较，差异无统计学意义（均为P>0.05，图2）。

图1各组小鼠术后生存情况

2.3 单宁酸缓解IRI小鼠肾组织病理损伤

Sham组与Sham+TA组肾小管上皮细胞形态规整，肾小球与肾小管结构基本正常；IRI组肾小管上皮细胞肿胀明显，肾小管管腔扩张明显，管腔内可见脱落坏死细胞，肾小管管型出现，刷状缘坏死脱落，间质水肿，大量炎症细胞浸润；IRI+TA组肾脏组织以上病理损伤减轻（图3A）。与Sham组比较，IRI组肾组织病理评分升高；与IRI组比较，IRI+TA组肾组织病理评分降低（均为P<0.05，图3B）。

2.4 单宁酸抑制IRI介导的炎症风暴

与Sham组比较，IRI组IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高；与IRI组相比，IRI+TA组IL-1β、IL-6、TNF-α水平下降（均为P<0.05，图4）。

图2 各组小鼠肾功能比较

图3 各组小鼠肾组织病理改变（HE,×400)

2.5 单宁酸抑制IRI中细胞铁死亡

与Sham组比较，IRI组丙二醛、亚铁离子水平升高，谷胱甘肽水平下降；与IRI组相比，IRI+TA组小鼠肾组织丙二醛、亚铁离子水平降低，谷胱甘肽水平升高（均为P<0.05，图5A～C）。

IRI组小鼠肾脏中GPX4表达减少，ACSL4表达增多；IRI+TA组小鼠肾组织中GPX4表达增多，ACSL4表达减少（图5D）。

2.6 单宁酸与铁死亡关键因子Nrf2分子对接结果

单宁酸可与Nrf2蛋白结合部位形成合适的空间互补（图6A），单宁酸可能与Nrf2的氨基酸残基位点以氢键的方式连接，结合的氨基酸残基分别为Val(604）、Val(465）、Leu(557）、Val(512）、Val(561）、Arg(326）、Gln(563）、Gly(564）（图6B）。单宁酸与铁死亡关键蛋白Nrf2结合能为-8.7 kcal/mol，具有较强的结合活性。

图4各组小鼠肾组织炎症因子水平比较

图5各组小鼠肾组织铁死亡相关因子及蛋白表达

图6单宁酸与Nrf2分子对接

IRI组肾组织中Nrf2与HO-1表达增多，IRI+TA组小鼠肾组织中Nrf2、HO-1表达量进一步增多（图7）。

图7 肾组织Nrf2和HO-1蛋白表达

3、讨论

目前，肾移植是终末期肾病患者最有效的治疗手段，但在肾移植过程中不可避免会出现肾IRI。研究表明肾IRI可造成移植物功能延迟恢复、排斥反应、移植物无功能，严重影响肾移植受者预后[19-20]。然而，目前肾IRI机制尚不明确，缺乏有效的治疗靶点。本研究构建了小鼠肾IRI模型，发现IRI 24 h后，小鼠血尿素氮、血清肌酐大幅度上升，且均在术后48 h内死亡，组织病理学显示肾脏组织中肾小管上皮细胞出现脱落坏死，刷状缘脱落，肾小管管型出现，间质水肿，大量炎症细胞浸润，而单宁酸干预后，IRI小鼠生存率提高，肾功能与肾组织病理损伤改善，炎症因子水平下降。

铁死亡是一种细胞死亡方式，与细胞脂质膜过氧化、铁离子代谢紊乱密切相关。细胞发生铁死亡的生理作用多种多样[21]：一方面器官结构细胞发生铁死亡，导致结构细胞失去功能，例如肾小管上皮细胞发生铁死亡，导致细胞死亡，影响重吸收功能。另外，细胞发生铁死亡后，会释放细胞体内的损伤相关分子模式，引发强烈炎症反应，引发机体炎症损伤。近来，多个研究表明铁死亡与IRI密切相关，抑制铁死亡发生，可有效改善心、肾、脑等IRI[22-25]。以铁死亡为治疗靶点的基础研究也发现：药物抑制铁死亡，有效改善动物模型IRI[12,24]。本研究中，IRI组小鼠肾脏组织中MDA与亚铁离子水平显著上调，GSH水平下调，铁死亡抑制蛋白GPX4表达下调，而促铁死亡蛋白ACSL4表达上调，而单宁酸可显著抑制细胞铁死亡。

Nrf2是机体抗氧化应激关键转录因子，机体在氧化应激损伤压力下，Nrf2激活进入细胞核，促进下游抗氧化因子转录，启动机体抗氧化应激系统[26-27]。近来研究发现Nrf2也是铁死亡关键负调控因子，Nrf2调控许多铁死亡相关蛋白转录，例如活性氧自由基清除系统相关蛋白（HO-1、GPX4）、谷胱甘肽合成相关蛋白（GSS、SLC7A11、GCLC）以及铁代谢相关蛋白[28-31]。在Nrf2转录调控蛋白中，HO-1对于维持机体铁代谢平衡、抗炎症损伤、抗氧化应激至关重要，发挥细胞保护作用[32-34]。Nrf2/HO-1通路激活可有效抑制细胞铁死亡，改善组织损伤[35-38]。既往研究者发现，在多种IRI模型中，Nrf2、HO-1蛋白表达量显著上升，Nrf2/HO-1通路激活，机体抗氧化损伤通路被激活[39-42]。本研究中也观察到相同结果：与Sham组相比，IRI组中Nrf2、HO-1蛋白表达量显著上调，机体抗氧化应激防御系统开启。分子对接发现单宁酸与铁死亡关键调控蛋白Nrf2有很强的结合活性，进一步实验验证发现，与IRI组相比，单宁酸干预小鼠后Nrf2蛋白含量显著上调，下游HO-1蛋白表达量也随之上调，Nrf2/HO-1通路进一步被激活，进一步增强机体抗氧化应激能力，从而改善IRI。单宁酸可有效改善小鼠IRI，且在人体中安全性得到广泛验证，在IRI防治方面临床潜力巨大，但其有效性与剂量安全阈值仍需要大样本临床试验验证。

综上所述，本研究发现单宁酸可有效改善肾IRI，其机制可能是与Nrf2蛋白结合，激活Nrf2/HO-1通路，抑制铁死亡。因此，靶向激活铁死亡关键因子Nrf2，抑制细胞铁死亡可作为IRI潜在治疗方法。未来，我们将借助生物信息学手段，进一步探索单宁酸调控IRI的可能机制，阐明IRI病理生理机制，寻找有临床潜力的治疗靶点。

参考文献:

[9]刘思齐,杨正飞.铁死亡:心肌缺血再灌注损伤分子机制和药物治疗研究新靶点[J].中山大学学报(医学科学版), 2022, 43(5):712-719.

[15]王灿,梁如铭,李健,等.单宁酸及其纳米颗粒的药理作用研究进展[J].中国现代中药, 2023, 25(12):2643-2650.

[31]张鹏,葛亮,孔令国,等.咪达唑仑通过调节Nrf2/HO-1信号通路对宫颈癌细胞铁死亡的作用及机制研究[J].实用医学杂志, 2023, 39(14):1740-1745.

基金资助:国家自然科学青年科学基金项目(82000089);

文章来源:王晓,刘东,庄锦炀,等.单宁酸通过抑制铁死亡改善小鼠肾脏缺血-再灌注损伤[J].器官移植,2024,15(06):912-919.