肾移植是目前治疗终末期肾病的最佳治疗方法，其中免疫排斥反应导致移植器官组织细胞不可逆的损害是影响移植器官长期存活的主要因素[1]。急性排斥反应主要是体液免疫和细胞免疫介导的排斥反应，如不早期进行诊断和治疗可导致移植物肾功能障碍的发生，降低移植肾的存活[2,3,4]。尽管各种免疫抑制剂或清除、抑制抗体的使用显著降低了急性排斥反应的发生率，但抗体水平可能发生反弹，排斥反应仍然是肾移植受者移植物长期存活的主要障碍[5]。研究表明急性排斥反应过程中，分子免疫信号要早于急性排斥反应病例损伤和临床的症状[6]；早期准确诊断急性排斥反应标志物对防治肾功能的损伤具有重要临床意义。

长链非编码RNA(longnon-codingRNAs,lncRNAs)是长度超过200nt的转录本，不具有蛋白编码能力。lncRNAs可以上调和下调基因表达，在真核生物发育模式和分化以及应激反应等过程中起重要作用[7]。lncRNAs可以作为微小RNA(microRNA,miRNA)海绵和支架，将染色质修饰因子招募到其作用位点调控基因表达[8]。lncRNAPGM5-AS1在人类多种癌症组织中过度低表达，其中包括肾透明细胞癌，起到抑癌作用[9,10,11]。PGM5-AS1在急性免疫排斥患者外周血清中表达降低[12]。作者探索了PGM5-AS1在肾移植后急性排斥反应中的表达模式，并检测了PGM5-AS1表达对肾小球内皮细胞存活、细胞周期、细胞凋亡和对巨噬细胞趋化性的影响，揭示急性排斥反应的生物学机制，以期为急性肾移植排斥反应患者肾损伤诊断治疗提供新思路。

1、对象和方法

1.1 设计

对比观察。

1.2 时间及地点

病例来自2016年6月至2018年6月郑州人民医院行肾移植的患者。

1.3 对象

收集46例肾移植患者，其中男28例，女18例；年龄29-56岁，平均年龄38岁。群体反应性抗体(PRA)<10%，供受者血型均相配，淋巴细胞毒实验阴性。根据术后1个月内发生急性排斥反应与否分为急性排斥反应组(17例)和非急性排斥反应组(29例)。术前1d及术后第1,2,3,4周各抽取外周血5mL待检[12]。所有患者签署知情同意书。研究方案经郑州人民医院伦理学委员会批准。

急性排斥反应诊断标准及移植后免疫抑制剂使用原则见参考文献[13]。

纳入标准：(1)年龄<60岁；(2)供受者血型均相配，淋巴细胞毒试验阴性。

排除标准：(1)心肝功能不全者；(2)肾移植后应用免疫抑制剂后发生感染。

1.4 材料

实验用细胞及试剂：人肾小球内皮细胞HRGEC和人巨噬细胞系(美国ATCC公司)；胎牛血清、DMEM细胞培养基、青霉素、链霉素和两性霉素B(美国Hyclone公司)；Trizol、Lipofectamine2000脂质体转染试剂(美国Invitrogen公司)，反转录试剂盒、2×SYBRGreenRealtimePCRMasterMix(宝生物工程(大连)有限公司)；MTT试剂盒、细胞凋亡试剂盒(碧云天生物技术公司)，Transwell小室(美国)，RNase和碘化丙啶(propidiumiodide,PI)(北京索莱宝科技有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 qPCR检测两组患者血清中PGM5-AS1表达

利用TRIzol试剂盒提取总RNA，反转录试剂盒进行反转录，2×SYBRGreenRealtimePCRMasterMix试剂盒检测PGM5-AS1表达，以actin为内参。PGM5-AS1正向引物：5´-GGGCGGCTGAAGAAAAGAAGAATG-3´，反向引物：5´-TCAACAGACGGCTTCAGTGGTTG-3´；actin正向引物：5´-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3´，反向引物：5´-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3´。

1.5.2 细胞培养

将冻存的细胞复苏，用含体积分数10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的DMEM培养基并置于37℃，体积分数5%CO2细胞培养箱中培养。

1.5.3 细胞转染

取对数生长期HRGEC细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达80%时，用Lipofectmine2000转染试剂将沉默PGM5-AS1重组质粒和空质粒转入细胞中，分别记为si-PGM5-AS1和si-control组，以及未转染HRGEC细胞为空白对照组(空白组)，培养6h后更换新鲜培养基，继续培养至48h进行后续实验研究。

1.5.4 细胞活力及细胞增殖检测

取对数生长期各组HRGEC细胞，采用qPCR检测转染后细胞中PGM5-AS1表达。

以1×104/孔的密度接种于96孔板，培养24,48,72h后，每孔加入100μLMTT溶液，37℃孵育4h，加入200μL二甲基亚砜，摇床孵育10min，酶标仪检测细胞在490nm处的吸光度值(A490nm值)。

1.5.5 细胞凋亡实验

取对数生长期各组HRGEC细胞，根据AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒说明书，依次加入5μL的AnnexinV-FITC和碘化丙啶，充分混匀后置于冰上，并在1h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5.6 流式细胞术分析细胞周期

取对数生长期各组HRGEC细胞，胰酶消化收集细胞，体积分数70%乙醇固定，去除固定液离心，用PBS清洗，细胞中加入RNase和碘化丙啶，调整细胞浓度为1×109L-1，染色后经300目尼龙膜过滤上流式细胞仪检测DNA含量，采用Modifit软件进行细胞周期分析。

1.5.7 ELISA检测细胞炎症因子分泌

各组细胞处理并培养48h后，按ELISA试剂盒说明书测定相关炎症因子白细胞介素13、白细胞介素6、γ干扰素和肿瘤坏死因子α的表达水平。

1.5.8 巨噬细胞趋化性试验

采用Transwell共培养方式，小室滤膜孔径5μm。将巨噬细胞种于上室置于无血清的培养基中，将各组HRGEC种于下室。培养结束后，取出小室，吸弃培养基，PBS清洗2次。用棉签擦去小室表面未迁移的细胞，加入40g/L多聚甲醛固定30min。PBS清洗细胞2次，加入0.4%结晶紫染色15min。PBS清洗后，显微镜观察巨噬细胞染色情况，并拍照，对迁移细胞进行计数。

1.6 主要观察指标

(1)肾移植患者血清中PGM5-AS1表达；(2)HRGEC细胞活力；(3)HRGEC细胞周期；(4)HRGEC细胞凋亡的情况；(5)HRGEC细胞炎症因子表达；(6)HRGEC细胞对巨噬细胞趋化能力的影响。

1.7 统计学分析

采用SPSS21.0软件进行统计分析，正态分布的计量资料以±s表示，两组数据采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 参与者数量分析

纳入患者46例，分为2组，试验过程无脱失，全部进入结果分析。

2.2 两组患者基线资料分析

两组患者的年龄、性别、血透时间、HLA错配数及术前肌酐水平等差异无显著性意义。见表1。患者分组流程图见图1。

表1|两组肾移植术的患者术前临床检验分析

图1|两组患者分组流程图

2.3 肾移植急性排斥反应患者血清中PGM5-AS1表达

结果显示，两组患者术前1d血清中PGM5-AS1表达差异无显著性意义(t=1.491,P=0.143)，肾移植急性排斥反应患者移植后1,2,3,4周血清中PGM5-AS1表达显著低于非急性排斥反应患者(t=4.027,8.136,10.842,9.801;P<0.05)。见表2。

表2|肾移植急性排斥反应患者血清中PGM5-AS1表达(±s)

2.4 下调HRGEC细胞中PGM5-AS1表达对细胞活力的影响

qPCR检测结果显示，与si-control组和空白组相比，si-PGM5-AS1组HRGEC细胞中PGM5-AS1表达水平显著降低(F=379.658,P<0.05)。MTT检测结果如表3所示，48,72h时si-PGM5-AS1组HRGEC细胞相对吸光度值较对照组显著降低(F=20.302,142.564;P<0.05)，表明抑制PGM5-AS1诱导的HRGEC细胞损伤。

2.5 下调HRGEC细胞中PGM5-AS1表达对细胞周期的影响

通过流式细胞术测量细胞周期分布发现，与空白组和si-control组相比，si-PGM5-AS1组的G0/G1期细胞比例显著增加(F=56.054,P<0.05),S期的细胞减少(F=172.328,P<0.05)，表明细胞周期阻滞于G0/G1期。见图2，表4。

2.6 下调HRGEC细胞中PGM5-AS1表达对细胞凋亡的影响

细胞凋亡检测结果显示，si-PGM5-AS1组HRGEC细胞凋亡率(13.48±1.63)%较对照组(6.79±0.82)%和空白组(5.24±0.77)%显著升高(F=5.135,P<0.05)，表明抑制PGM5-AS1表达诱导HRGEC细胞凋亡，见图3。

表3|抑制PGM5-AS1表达对HRGEC细胞相对吸光度值变化的影响(±s,n=9)

表4|各组HRGEC细胞的细胞周期分布(±s,n=9)

2.7 下调HRGEC细胞中PGM5-AS1表达对细胞炎症因子表达的影响

ELISA结果显示，si-PGM5-AS1组HRGEC细胞炎症因子白细胞介素13较对照组和空白组显著降低(F=53.266,P<0.05)，而炎症因子白细胞介素6、γ干扰素和肿瘤坏死因子α表达显著升高(F=578.098,260.075,557.172;P<0.05)，见表5。

表5|抑制PGM5-AS1表达对HRGEC细胞白细胞介素13、白细胞介素6、γ干扰素和肿瘤坏死因子α表达的影响(±s,n=9,ng/L)

2.8 下调HRGEC细胞中PGM5-AS1表达对巨噬细胞趋化能力的影响

Transwell结果显示，si-PGM5-AS1组穿过小孔的巨噬细胞数量(94.56±6.64)明显要比si-control组(31.43±4.80)和空白组(28.89±3.57)增多，差异有显著性意义(P<0.05)。见图4。

3、讨论

肾移植是针对终末期肾病的最佳治疗手段，可提高患者的生活和生存时间[14]。随着肾移植手术技术的日趋完善、组织配型技术的开展、新型免疫抑制剂的应用和围术期抗体的靶向治疗，肾移植后免疫排斥反应的发生和严重程度大幅下降，但术后患者发生急性免疫排斥依旧是影响患者预后的不良因素[15]。如果早期诊断和及时治疗急性排斥反应，可有效降低移植器官的病理损害程度，延长移植器官的存活时间。非编码RNA可作为多种疾病的标志物，具有易于获得和较稳定的存在于外周血中的特点，能有效的监测疾病的动态和治疗效果[16]。

图2|应用流式细胞术对HRGECs细胞进行细胞周期分析

图3|采用AnnexinV-FITC/PI染色及流式细胞术检测各组HRGEC细胞凋亡率

图4|Transwell检测下调HRGEC细胞中PGM5-AS1表达对巨噬细胞趋化能力的影响(×200)

在过去的十年中，许多研究报道了这些非编码RNA通过的多种机制在生物过程中发挥综合功能[17]。lncRNAs作为新发现的一类非编码基因，为长度超过200个核苷酸的非编码RNA[18]。lncRNAs解释许多人类疾病的诊断、发病和发展机制，以及作为生物标志物预测疾病的预后和治疗的候选基因[19]。研究发现，lncRNAs可影响组织的稳定性，与急性肾损伤、肾小球疾病及急性同种异体移植排斥反应等多种病理过程关系密切，并在肾移植术后急性排斥反应早期诊断等方面潜力巨大[20]。lncRNA-ATB可影响肾脏细胞表型，促进免疫抑制剂对肾的毒性[21]。国内有学者利用蛋白组和基因组技术，同时检测肾移植术后急性排斥反应患者和非急性排斥反应患者的lncRNAs表达水平，通过数据分析明确了5339种lncRNAs表达水平的变化，其中2191个lncRNAs表达上调，3148个lncRNAs表达下调；提示lncRNAs表达水平差异与急性排斥反应发生相关，为肾移植术后急性排斥反应的检测提供了新的诊断[22]。此次研究结果显示，急性排斥反应患者血清中PGM5-AS1表达量显著低于非急性排斥反应患者，该结果提示PGM5-AS1参与肾移植患者急性排斥反应发生发展过程。

细胞凋亡是由基因主动控制的细胞死亡方式，现证实靶细胞凋亡是免疫排斥致使肾移植功能失常的主要机制之一[23]。细胞凋亡介导移植肾移植器官细胞免疫排斥反应，细胞可经激活凋亡效应分子caspase-3同时释放穿孔素和颗粒酶素B，启动靶细胞的凋亡过程[24]。此次研究结果显示，细胞实验中，验证沉默PGM5-AS1表达可抑制细胞存活、诱导细胞周期阻滞和增加细胞凋亡，说明PGM5-AS1表达降低不利于HRGEC生长及增加细胞凋亡。

炎症因子是由单核巨噬细胞及淋巴细胞产生的一种低分子糖蛋白或多糖[25]。急性排斥反应主要是炎症细胞大量浸润，造成细胞免疫紊乱[26]，急性排斥反应过程中可通过T淋巴细胞和细胞毒T性细胞，促进B淋巴细胞的分化，产生移植物表面抗体，产生大量炎症因子如白细胞介素2、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和γ干扰素等[27]。急性排斥反应过程中，肾小管上皮细胞中肿瘤坏死因子αmRNA表达局部增高，提示肿瘤坏死因子α参与免疫排斥反应[27]；白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、γ干扰素等炎症因子调控肾移植微环境影响肾脏细胞凋亡[28]。此次研究发现沉默PGM5-AS1表达明显增加巨噬细胞的趋化性和增加促炎因子白细胞介素6、γ干扰素和表达，抑制白细胞介素13表达，这表明PGM5-AS1可调控肾移植急性排斥反应微环境中炎症因子的表达。

综上所述，研究荧光定量PCR分析发现PGM5-AS1在肾移植急性排斥反应患者血清中低表达，并探究其可能对肾小球内皮细胞的作用机制。PGM5-AS1可抑制肾小球内皮细胞的生存、诱导细胞周期阻滞和增加其凋亡，并参与增加炎症因子白细胞介素6、γ干扰素和肿瘤坏死因子α表达、抑制白细胞介素13表达和提高巨噬细胞趋化性，提示PGM5-AS1可能作为肾移植急性排斥反应诊断和治疗的分子靶点。

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基金:河南省医学科技攻关计划联合共建项目(2018020823),项目负责人:曲青山.