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DcR2与急性肾损伤患者临床及病理特征的相关性分析

2024-03-18 88 上传者：管理员

摘要：目的拟探讨诱骗受体2(decoy receptor 2,DcR2)与急性肾损伤(acute kidney injury, AKI)患者临床指标与病理损伤的相关性。方法纳入陆军特色医学中心肾内科2018年1月至2021年11月51例经肾活检诊断AKI患者及对照患者20例。ELISA检测患者尿DcR2/Cr水平；相关性分析尿DcR2/Cr水平与肾小管DcR2表达量、肾功指标之间的相关性；利用免疫组化检测DcR2表达与定位，免疫荧光共染分析DcR2与肾小管间质纤维化标志物α-SMA、FSP1之间的共定位关系。结果 AKI组尿DcR2/Cr显著高于对照组(P<0.05); DcR2特异性高表达于AKI患者肾小管上皮细胞，DcR2表达阳性率高于对照组(P<0.01);尿DcR2/Cr与尿素氮、肌酐呈正相关(r=0.426,P<0.05;r=0.462,P<0.05),与eGFR呈负相关(r=0.536,P<0.01);AKI组患者肾组织DcR2表达量与尿DcR2/Cr、肾小管萎缩及间质纤维化程度呈正相关(r=0.808、0.457,P<0.01);DcR2阳性的肾小管细胞周围高表达纤维化标志物α-SMA与FSP-1。结论 AKI患者尿DcR2/Cr及肾组织DcR2表达变化与肾功能指标及肾组织慢性损伤密切相关，提示DcR2或可作为评估AKI损伤及预后的潜在生物标志物。

关键词：
AKI
急性肾损伤
生物标志物
相关性分析
诱骗受体2
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急性肾损伤(acute kidney injury, AKI) 是急危患者中的常见合并症，在住院患者中发病率为21.6%,病死率23.9%～60%;存活的AKI患者30%～70%进展为慢性肾脏病(chronic kidney disease, CKD), 2～5年进展为终末期肾脏病或终生需要透析的患者可达30%[1,2,3,4]。目前研究认为，AKI 后存活肾小管细胞再生修复障碍是 AKI 进展为CKD的重要原因，并且肾小管细胞衰老是其主要细胞生物学事件之一。诱骗受体2(decoy receptor 2,DcR2),被认为是衰老细胞的生物标志[5],既往研究发现与肿瘤分化程度及预后有关[6,7]。DcR2为Ⅱ型跨膜受体，胞外段易被剪切[8],在血清及尿液中可被检测[9],既往研究发现血清DcR2可用于评估前列腺癌患者的预后[7]。在糖尿病肾病及IgA肾病肾组织中研究发现DcR2特异表达于衰老肾小管上皮细胞，且尿DcR2水平与肾间质纤维化损伤密切相关[10,11],进一步体内外研究表明DcR2可通过介导肾小管细胞衰老表型加速肾间质纤维化[12,13]。在缺血再灌注损伤大鼠模型中，发现尿DcR2 水平可反映AKI大鼠损伤程度及预后[14]。但迄今为止，尚不明确DcR2在AKI患者肾组织中的表达变化，以及尿DcR2水平变化的意义。本研究拟分析AKI患者尿液DcR2/Cr水平、肾组织DcR2表达，及其与肾组织损伤程度和肾功能之间的相关性，旨在为评估AKI损伤程度及预后提供潜在生物标志物。

1、资料与方法

1.1 研究对象

纳入2018年1月至2021年11月在陆军特色医学中心肾内科经肾活检诊断为急性肾损伤患者51例，肾功能符合改善全球肾脏病预后组织(Kidney Disease: Improving Global Outcomes, KDIGO)对于AKI的诊断标准：48 h内Scr上升≥26.4 mmol/L,或在7 d内较基础值增加≥50%;年龄≥18岁。排除合并肾病综合征、慢性肾脏病、肿瘤、严重的心脏及肝脏疾病患者。对照组纳入陆军特色医学中心泌尿外科2018年1-12月肾错构瘤切除的20例患者，且肾组织经常规病理染色证实无病变的患者。患者尿液样本于肾活检穿刺前1 d收集，在15 min 3 000 r/min的离心条件下吸取上清液，冻存于-80 ℃冰箱。本研究通过本中心伦理委员会批准(伦理审查批件号：2022-113),参与研究的患者均签署知情同意书。

1.2 酶联免疫吸附测定方法检测尿DcR2水平

采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno-sorbent assay, ELISA)方法，按照人DcR2 ELISA试剂盒(上海恒远生物科技有限公司)说明书检测尿液中DcR2水平。将尿标本用试剂盒配套的样本稀释液稀释5倍， 37 ℃孵育30 min。为了避免肾小管对尿液稀释与浓缩的影响，尿液DcR2水平使用尿肌酐校正。

1.3 肾组织病理评分

对肾组织分别进行急性损伤和慢性损伤病理评分。急性损伤定义为肾小管上皮细胞坏死、脱落、基底膜裸露，炎细胞浸润；慢性损伤定义为肾小管萎缩及间质纤维化程度；均采用半定量评分：0分，无病变；1分，<25%的病变面积；2分，25%≤x<50%的病变面积；3分，50%≤x<75%的病变面积；4分，≥75%的病变面积[15,16,17]。

1.4 免疫组化检测肾组织DcR2表达

DcR2检测采用EnVision二步法。将肾组织固定包埋，切片厚度2 μm, 脱蜡水化，抗原修复，3% H2O2溶液除去内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，一抗使用兔抗人 DcR2 单克隆抗体(1∶500) ,并在4 ℃下孵育过夜，标本均在同一条件下检测。细胞膜和(或)细胞质呈棕黄色为 DcR2 表达阳性细胞。随机选取3～6个200倍高倍视野，对DcR2表达阳性的肾小管进行计数，计算肾小管上皮细胞DcR2阳性表达百分率，取其平均值作为衡量指标。2名计数人员为本研究不相关的病理医师。

1.5 免疫荧光共染

切片常规脱蜡、水化及抗原修复。一抗为兔抗DcR2抗体[英国艾博抗(上海)贸易有限公司ab108421;1∶100]、鼠抗α-SMA(中国武汉博士德生物工程有限公司BM0002;1∶100)、兔抗FSP-1[英国艾博抗(上海)贸易有限公司ab197896;1∶100],二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG(中国碧云天生物技术公司A0568;1∶100)、Cy3标记的山羊抗兔IgG和FITC标记的山羊抗兔IgG(中国碧云天生物技术公司A0516和A0562;1∶100)。最后使用DAPI(中国碧云天生物技术公司C1006)染色细胞核10 min, PBS洗涤后甘油封片。使用荧光成像显微镜(日本尼康株式会社)采集图像。

1.6 统计学分析

应用SPSS 26.0及GraphPad Prism 9.0统计学软件进行统计分析和处理，正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),相关性分析采用Pearson相关分析法；非正态分布的计量资料以M(P25, P75)表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H秩和检验，采用Spearman检验进行相关性分析。分类变量以百分比(%)表示，采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 患者基线特征

本研究共纳入51例AKI患者(表1),其中男性30例，女性21例，健康对照组中男性7例，女性13例。AKI组血清学指标尿酸、尿素氮、胱抑素C、血肌酐水平较对照组升高(P<0.05),但尿液指标尿肌酐水平较对照组降低(P<0.05),而年龄、性别、收缩压、舒张压在2组中差异无统计学意义(P>0.05,表1)。病因分析显示药物导致的AKI比例最高。

表1 AKI患者的临床指标特征

2.2 AKI患者尿DcR2/Cr与肾功能指标的相关性

由于肾小管对尿液有稀释与浓缩的影响，将测得的尿DcR2水平及尿N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(N-Acetyl-β-D-glucosaminidase, NAGase或NAG)用尿肌酐校正，获得尿DcR2/Cr及NAG/Cr值。AKI组尿DcR2/Cr与NAG/Cr水平均较对照组升高，差异有统计学意义(P<0.05,图1)。尿DcR2/Cr水平与血清学指标尿素氮、血肌酐及尿液生物标志物尿NAG/Cr呈正相关，与eGFR呈负相关，与年龄、血压等其他临床指标无关(表2)。

图1 对照组与AKI组的尿DcR2/Cr、NAG/Cr水平

表2 尿DcR2/Cr与临床指标的相关性

2.3 DcR2在AKI患者肾组织中的表达及分布

为了研究DcR2在肾组织中的表达量及定位分布，采用免疫组织化学方法检测DcR2在AKI患者肾组织中的表达。如图2所示，对照组中DcR2表达较少，而在AKI患者中DcR2高表达于肾小管上皮细胞的胞膜及胞浆，且肾小管DcR2阳性表达率明显高于对照组(P<0.01)。

图2 对照组与AKI患者肾小管上皮细胞DcR2的表达及分布

2.4 肾小管上皮细胞DcR2表达量与尿DcR2/Cr及病理损伤评分的相关性

由于DcR2特异性高表达于AKI肾小管细胞，其胞外段可被剪切，从而可在尿液中被检测。对肾组织DcR2表达量与尿DcR2/Cr进行相关性分析，结果表明肾小管细胞DcR2阳性表达率与尿DcR2/Cr水平呈正相关(r=0.808,P<0.001)(图3)。对AKI患者肾组织进行病理损伤评分(图4),进一步相关性分析表明肾小管DcR2表达量与慢性损伤评分即肾小管间质纤维化程度呈正相关(r=0.457,P=0.001),与急性损伤评分不相关(r=0.072,P=0.615),提示DcR2可能参与AKI患者肾小管间质纤维化发生发展。

图3 肾小管DcR2阳性率与尿DcR2/Cr水平的相关性分析

2.5 DcR2与纤维化标志共定位分析

为了进一步研究DcR2与AKI患者肾间质纤维化之间的关系，采用免疫荧光共染分析DcR2与纤维化标志α-SMA及FSP-1的共定位情况。结果显示 DcR2阳性肾小管细胞周围高表达α-SMA及FSP-1(图5、6),表明DcR2阳性肾小管上皮细胞与AKI后肾间质纤维化密切相关。

3、讨论

AKI是由多病因引起的临床综合征，其发病机制复杂，病理表现多样，临床特征异质性大。近年来AKI发病率逐年升高，病死率居高不下且极易发展为慢性肾脏病及终末期肾病[18,19]。目前诊断AKI需要至少2次血肌酐值，且血清肌酐升高时肾脏的损伤已经进展至严重失代偿状态，缺乏敏感度和特异度[20],临床迫切需要更加敏感特异的生物标志物以早期诊断AKI或精准评估AKI预后，从而尽早干预以避免肾功能持续受损，改善肾脏预后。

3.1 肾小管上皮细胞衰老促进AKI向CKD转变

肾小管上皮细胞在缺血缺氧及肾毒素等损害刺激下是最容易受损的肾实质细胞，可发生坏死、凋亡、衰老等细胞生物学事件。肾小管上皮细胞富含大量线粒体，AKI后极易发生细胞衰老[21]。肾小管细胞衰老不仅抑制细胞增殖，而且还可分泌炎症因子、趋化因子等衰老相关分泌表型[22],从而导致AKI肾脏不良修复，促进AKI向CKD进展；当抑制肾小管细胞衰老可促进肾脏修复[5],进而改善AKI预后。因此，肾小管上皮细胞衰老是 AKI 向CKD 转变的一个重要的病理生理过程。

图4 AKI患者肾组织急性及慢性病理改变与评分(PAS染色)

图5 DcR2与纤维化标志物α-SMA共定位情况(免疫荧光染色)

图6 DcR2与成纤维细胞标志物FSP-1共定位情况(免疫荧光染色)

3.2 衰老标志物DcR2与肾功能损伤程度之间的关系

DcR2是肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体，相对分子质量为42 KDa, 通过激活NF-κB通路抵抗细胞凋亡[23],是细胞衰老的生物标志物[5]。既往研究表明在前列腺癌及乳腺癌等肿瘤细胞中均高表达DcR2,与肿瘤细胞转移以及预后不良等情况相关[7,24]。在肾脏疾病方面，研究证实尿DcR2/Cr可从肾小管细胞衰老角度评估IgA肾小管间质损伤[25]。本课题组前期在肾缺血再灌注损伤大鼠模型中研究发现，轻度损伤组尿DcR2/Cr于第1天达峰值后逐渐回落至正常水平，重度损伤组于3 d后达峰值后逐渐回落，但35 d后仍高于对照组，表明尿DcR2/Cr与AKI损伤程度及预后相关[26]。本研究进一步在AKI患者中发现尿 DcR2/Cr水平显著高于对照组，与eGFR负相关，这与前期的研究结果具有一致性[26]。虽然部分AKI患者由于少尿甚至无尿等情况而缺乏尿液DcR2/Cr数据，但现有数据仍表明尿DcR2/Cr水平与肾功能损伤程度密切相关。当前临床常用血肌酐及胱抑素C评估AKI预后，具有一定的局限性。原因在于血肌酐不仅不能鉴别急慢性肾损伤，也不能反映肾脏损伤的性质、部位及程度。胱抑素C主要由有核细胞产生，几乎被肾小球过滤，约99%被近端小管重吸收和分解代谢，肌肉质量、吸烟、炎症、肥胖、甲状腺疾病、恶性肿瘤和糖皮质激素会影响胱抑素C水平，从而降低其作为肾脏损伤预后评估的价值[27]。

3.3 DcR2与肾小管间质纤维化相关

本研究利用免疫组化法检测发现DcR2特异表达于近端肾小管上皮细胞胞膜和胞浆，与糖尿病肾病及IgA肾病中表达部位一致[10,11],且AKI组患者DcR2表达阳性率高于对照组患者。相关性分析表明肾小管细胞DcR2表达水平与肾小管萎缩与间质纤维化面积呈正相关，与前期在肾缺血再灌注损伤大鼠实验中的结果一致[26]。以上提示，肾组织DcR2表达可能参与AKI后肾组织纤维化。既往在糖尿病肾病及IgA肾病中发现，DcR2与衰老标志物(P16、P21)和纤维化标志物共表达，通过介导肾小管细胞衰老表型促进了肾小管间质纤维化，从而导致肾脏疾病进展[12,13,28]。在缺血再灌注损伤大鼠肾组织中，DcR2阳性衰老细胞周围高表达肾间质纤维化标志α-SMA与CollagenⅣ[26],本研究在AKI患者肾组织样本中发现α-SMA与FSP-1主要呈现在DcR2阳性肾小管细胞周围。上述结果提示，DcR2可能促进AKI肾小管间质纤维化的发生发展，DcR2可作为评估AKI患者肾脏预后的潜在生物标志物。

综上所述，AKI患者肾组织及尿液DcR2的表达与其肾组织损伤程度及肾功能显著相关，表明尿DcR2可作为评估AKI肾小管损伤及预后的潜在无创性生物标志物。然而本研究为小样本单中心横断面研究，未来需要扩大样本量并进行队列研究，以进一步确立尿DcR2在判断AKI预后中的价值。此外，DcR2作为衰老细胞生物标志，特异性表达于肾小管细胞，提示DcR2或可作为清除衰老肾小管细胞的靶标，尚需进一步体内外研究证明靶向干预DcR2在改善AKI肾脏预后中的作用。

参考文献:

[2]杨莉.急性肾损伤发病与修复的机制[J].中华肾病研究电子杂志,2013,2(3):120-124.

[14]刘佳睿,陈佳,陈客宏,等.缺血再灌注大鼠肾组织及尿液DcR2表达变化与肾损伤的关系[J].第三军医大学学报,2017,39(4):342-348.

[25]胡威,陈佳,林利容,等.尿DcR2/Cr评价IgA肾病肾小管间质损伤程度[J].第三军医大学学报,2017,39(20):2030-2034.

[26]刘佳睿.缺血再灌注大鼠肾组织及尿DcR2的变化与肾损害慢性化的关系[D].重庆:第三军医大学.

基金资助:重庆市科卫联合医学科研项目青年项目(2023QNXM011);创伤､烧伤与复合伤国家重点实验室(SKLKF202202)~~;

文章来源:易香伶,罗佳,柏利华等.DcR2与急性肾损伤患者临床及病理特征的相关性分析[J].陆军军医大学学报,2024,46(05):484-490.