糖尿病肾病(DKD)是全球范围内糖尿病最常见的慢性并发症之一，我国2型糖尿病患者的DKD患病率为21.8%。DKD发病机制较为复杂，涉及糖脂代谢紊乱、血流动力学异常、氧化应激、多种细胞因子参与及遗传等多方面因素，其发病过程缓慢，时间长，需要长期治疗。尽管目前临床对DKD采取各类治疗措施降低了其恶化风险，但DKD依然是终末期肾脏病(ESRD) 的首要原因[1,2]。DKD根据病证结合的原则，归属于中医学消渴病继发的“水肿”“虚劳”“关格”等范畴，其中DKD肾阳虚证以小便频数、下元虚冷为主要表现，应用以益智仁、乌药为主药的缩泉丸为主，临床已取得很好的疗效[3,4]。课题组前期研究发现益智仁-乌药对DKD模型小鼠肾功能有良好的保护作用[5],但作用机制不清，本研究采用自发性糖尿病小鼠C57BL/KSJ-db/db建立DKD模型[6],观察细胞外基质(ECM)相关纤维化基因：黏连蛋白(Laminin)、纤维连接蛋白(Fibronectin) 和Ⅰ/Ⅳ胶原蛋白(Collagen)表达情况，从ECM角度探讨中药益智仁-乌药配伍治疗DKD的作用机制。

1、材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/KSJ-db/db(下文简称db/db) 小鼠，SPF级，雄性，7周龄，体质量(30±2)g, 50只；C57BL/KSJ-db/m(下文简称db/m)小鼠，SPF级，雄性，7周龄，体质量(30±2)g, 10只，均购自常州卡文斯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(苏)2016-0010。实验动物于20～26 ℃室温屏障系统内饲养，12 h/12 h昼夜明暗交替，使用许可证号：SYXK(川)2017-204。本实验得到了海南医学院实验动物福利伦理委员会批准。

1.2 药物

益智仁、乌药药材均购于成都中医药大学附属医院。经成都中医药大学黄巍教授鉴定均为正品。益智仁10 g, 乌药10 g, 加水500 ml浸泡30 min, 煎煮3次，每次30 min, 合并滤液浓缩，制备成含生药量1.6 g/ml的浸膏[5]。缬沙坦分散片(桂林华信制药有限公司，H20080820)。实验时，缬沙坦用少量无水乙醇溶解，其余供试药物用蒸馏水配成相应浓度混悬液，备用。

1.3 主要试剂与仪器

24 h尿蛋白试剂盒(上海江莱科技有限公司，201908);Animal Total RNA Isolation试剂盒(成都福际生物技术有限公司，RT-01022)、iScript cDNA Synthesis试剂盒(BIO-RAD,1708891)、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix(BIO-RAD,1725271);Laminin、Fibronectin和Collagen Ⅰ、Ⅳ、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH,B661304) 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成；Laminin抗体(ab30320)、Fibronectin抗体(45688)、Collagen Ⅰ、Ⅳ抗体(ab21286、ab19808)、Alexa Fluor 488二抗(ab150081)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,ab104139),英国Abcam公司。

快速血糖仪(美国Abbott Diabetes Care);Multiskan GO酶标仪(美国Thermo);BE-9008微孔板孵育振荡器(其林贝尔);N50T微量核酸分析仪(德国IMPLEN);CFX荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(美国BIO-RAD);A300基因扩增仪(杭州朗基);CM1950冷冻切片机(德国Leica);DM3000荧光显微镜(德国Leica);H7650透射电子显微镜(日本Hitachi)。

1.4 模型建立与动物分组

实验动物适应性喂养1 w后，随机取db/db、db/m小鼠各7只，收集24 h尿液测尿微量白蛋白，db/db小鼠出现微量蛋白尿且明显高于db/m小鼠(P<0.05)[6]则认为造模成功，即可开始给药干预。db/m小鼠为正常组；将db/db模型小鼠完全随机分为模型组、缬沙坦组16 mg/(kg·d)、益智仁-乌药低、中、高剂量组4、8、16 g生药/(kg·d),每组10只。各给药组予相应药物灌胃治疗，灌胃体积为10 ml/(kg·d),正常组和模型组予等体积生理盐水，连续给药8 w。

1.5 血糖检测及口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

给药期间，所有小鼠于给药0、2、4、6、8 w每行尾静脉采血，用快速血糖仪检测空腹血糖，检测前禁食6 h。所有小鼠测定血糖值后以 3 g/kg 50%葡萄糖水溶液10 ml/kg灌胃，测定给予葡萄糖后30、60、120 min各组血糖值。

1.6 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组24h蛋白尿

给药第8周用代谢笼禁食不禁水收集24 h尿液，2 500 r/min离心20 min, 仔细收集上清液，采用ELISA测试小鼠24 h尿蛋白水平。

1.7 电镜观察肾小球基底膜改变

取左侧肾脏组织，小心将其剖成两半，留取肾脏标本：一侧以最快的速度放入2.5%戊二醛固定液中修剪成1 mm3左右的小块，挑出3～5粒标本，放入盛满2.5%戊二醛固定液的1.5 ml EP管中待测。

1.8 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组肾脏中Laminin、Fibronectin、CollagenⅠ、Ⅳ mRNA表达

取右侧肾脏组织相同部位冻存入液氮中，检测时每60 mg组织添加500 μl裂解液，Animal Total RNA Isolation试剂盒提取各组肾脏总RNA,微量核酸分析仪检测总RNA含量，cDNA合成试剂盒逆转录，RT-qPCR仪进行基因片段扩增。引物序列(5′-3′):Laminin: 上游TGCTCACAAGACGGCGAATAAGAC,下游ATCGTAATGCCTTGCTGCTTCCTC;Fibronectin: 上游AGTGGCTGAAGTCGCAAGGAAAC,下游TAAGTCTGGGTCACGGCTGTCTC;CollagenⅠ:上游GG CAACAGCAGGTTCACCTACTC,下游GTCAGCACCAC CAATGTCCAGAG;Collagen Ⅳ:上游CTGGCACAAAAGGGACGAG,下游ACGTGGCCGAGAATTTC ACC。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参基因，按照2-△△Ct值计算目的基因的相对表达量。

1.9 免疫荧光检测肾组织Laminin、Fibronectin、CollagenⅠ、Ⅳ蛋白表达

采集右侧肾脏相同部位，置于液氮中，制作连续5 μm 冰冻切片，用预冷丙酮固定 10 min。10%山羊血清封闭 30 min, 并在对应抗体中孵育标记目标蛋白，4 ℃过夜。磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗3次，荧光二抗孵育1 h。PBS 漂洗3次后，含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)封固液封片，荧光显微镜下观察各目标蛋白表达。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism8.3软件计算曲线下面积(AUC)。 计量资料采用One-way ANOVA分析、Tukey检验及Dunnett T3检验。

2、结果

2.1 益智仁-乌药对DKD小鼠血糖的影响

模型组较正常组空腹血糖(治疗0 w)和OGTT AUC明显升高(P<0.01)。与模型组相比，治疗后缬沙坦组和益智仁-乌药低剂量组DKD空腹血糖和OGTT AUC略有降低，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 益智仁-乌药对DKD小鼠24h蛋白尿的影响

模型组较正常组24 h蛋白尿明显增加(P<0.01)。与模型组相比，治疗后4组24 h蛋白尿均有减少，其中以益智仁-乌药中剂量组差异显著(P<0.01)。见表1。

2.3 各组肾小球基底膜厚度比较

与正常组相比，模型组肾小球基底膜明显增厚伴细胞外基质沉积，足细胞足突融合伴微绒毛化；缬沙坦组肾小球基底膜轻微增厚伴足细胞融合；益智仁-乌药各剂量组肾小球基底膜轻微增厚，未见明显基质沉积，足细胞足突少量融合，以中剂量组疗效最为明显。见图1。

表1 益智仁-乌药对DKD小鼠空腹血糖、OGTT AUC及蛋白尿的影响

图1 各组肾小球基底膜厚度(透射电镜，×25 000)   

2.4 各组肾脏Laminin、Fibronectin、CollagenⅠ、Collagen Ⅳ mRNA表达

与正常组比较，各组Laminin、Fibronectin、CollagenⅠ、Ⅳ mRNA表达均升高，其中模型组上述指标均明显升高(P<0.01),益智仁-乌药低、中剂量组Fibronectin mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组相比，缬沙坦组和益智仁-乌药各剂量组Laminin、Fibronectin、Collagen Ⅰ、Ⅳ mRNA表达均降低，其中益智仁-乌药中、高剂量组及缬沙坦组Laminin mRNA显著降低(P<0.05);缬沙坦组和益智仁-乌药高剂量组Fibronectin mRNA表达明显下降(P<0.01);缬沙坦组与益智仁-乌药低、中、高剂量组CollagenⅠmRNA表达显著下降(P<0.05,P<0.01);缬沙坦组和益智仁-乌药高剂量组CollagenⅣ mRNA明显降低(P<0.05,P<0.01)。与益智仁-乌药低剂量组比较，缬沙坦组及益智仁-乌药高剂量组Fibronectin mRNA表达明显降低(P<0.05)。见表2。

2.5 各组肾组织Laminin蛋白表达比较

与正常组相比，模型组肾小球代偿性增大，肾小球毛细血管系膜部有大量Laminin沉积；缬沙坦组肾小球无明显增大，系膜部Laminin表达量较正常组升高；益智仁-乌药中高剂量组肾小球形态未见明显改变，系膜部Laminin表达量与正常组无明显差异。见图2。

表2 益智仁-乌药对DKD小鼠肾组织Laminin、Fibronectin、Collagen Ⅰ、Ⅳ mRNA表达量的影响

图2 各组肾组织Laminin蛋白表达(免疫荧光染色，×200)   

2.6 各组肾组织Fibronectin蛋白表达比较

与正常组相比，模型组肾小球毛细血管系膜部有大量Fibronectin沉积；缬沙坦组和益智仁-乌药各剂量组肾小球形态未见明显改变，肾小球毛细血管系膜部Fibronectin表达量无明显差异。见图3。

图3 各组肾组织Fibronectin蛋白表达(免疫荧光染色，×200)   

2.7 各组肾组织CollagenⅠ蛋白表达比较

与正常组相比，模型组肾小球入球血管部位和肾小囊壁层有大量Collagen Ⅰ沉积；缬沙坦组肾小球入球血管部位未见Collagen Ⅰ沉积，肾小囊壁层有少量Collagen Ⅰ沉积；益智仁-乌药各剂量组肾小球入球血管部位未见CollagenⅠ沉积，肾小囊壁层有少量CollagenⅠ沉积，较缬沙坦组沉积量减少，高剂量抑制Collagen Ⅰ沉积作用最强。见图4。

2.8 各组肾组织CollagenⅣ蛋白表达比较

与正常组相比，模型组肾小球代偿性增大，肾小球毛细血管系膜部和基膜部有大量Collagen Ⅳ沉积；缬沙坦组和益智仁-乌药各剂量组肾小球形态未见明显改变，肾小球毛细血管系膜部和基膜部 Collagen Ⅳ表达量未见明显差异。见图5。

图4 各组肾组织Collagen Ⅰ蛋白表达(免疫荧光染色，×200)  

图5 各组肾组织Collagen Ⅳ蛋白表达(免疫荧光，×200)   

3、讨论

DKD典型的病理改变是肾小球及肾小管上皮细胞的体积增大，基底膜增宽，ECM增多，最终引起肾小球的硬化、肾小管及间质中纤维组织增多。其中ECM过度堆积是DKD发生的主要病理特点[7]。缬沙坦是血管紧张素受体拮抗剂，可以强效抑制肾素-血管紧张素系统(RAS) 活性，减少肾脏慢性损伤，对2型糖尿病和DKD患者具有肾保护作用，临床上常用于改善肾小球通透率，减少ECM沉积[8]。益智仁为海南道地药材，辛、涩、温，归肾、脾经，具有温肾补肾、固精缩尿等功效，用于下元虚冷，肾虚不固之尿频、遗尿、白浊、遗精、早泄等症，有标本兼顾之功。乌药，辛、温，归肺、脾、肾及膀胱经，具有行气止痛、温肾散寒的功效，乌药能下达肾与膀胱，可除膀胱冷气以助气化。《校注妇人良方》中益智仁、乌药配伍使用以治下焦虚寒、尿频、遗尿等。益智仁、乌药二药配伍，一散一收，温下元、散寒邪，补脾肾、缩小便之力益彰。课题组前期研究表明，益智仁-乌药能改善小鼠DKD的损害，可以下调周期素激酶抑制剂P27(p27kip1)蛋白，延缓肾功能的衰退[9]。

本实验结果发现，益智仁-乌药配伍可明显减轻模型小鼠肾小球基底膜增厚及ECM沉积，维持足细胞形态。ECM是复杂的蛋白质网状结构，主要由Laminin、Fibronectin和各型Collagen(Ⅰ、Ⅳ)等组成。上述蛋白表达情况对DKD疾病发展程度有较大的参考价值[10]。位于肾小球毛细血管袢和系膜区的ECM,是肾小球基底膜的主要基质形式。研究表明ECM过度沉积、足细胞异常和肾小管间质纤维化，在DKD的发展中起关键作用[11]。本研究结果显示，益智仁-乌药配伍能有效降低ECM相关纤维化基因Laminin、Fibronectin、Collagen Ⅰ、Ⅳ mRNA表达，益智仁-乌药配伍对Laminin、Collagen Ⅰ、Ⅳ蛋白表达降低有明显作用，以高剂量组效果显著。

综上，益智仁-乌药在病理学层面能减轻DKD肾小球基底膜增厚及ECM沉积，从而达到能改善DKD小鼠肾脏功能的作用，其机制可能与调控Laminin、Fibronectin、Collagen Ⅰ、Ⅳ基因和蛋白表达密切相关。本研究从减少ECM沉积角度，部分揭示了中药益智仁-乌药配伍治疗DKD的作用机制。

参考文献:

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[5]尹德辉,宋丽,谢毅强,等.益智仁-乌药配伍通过调控细胞自噬对糖尿病肾病小鼠足细胞的保护作用研究[J].时珍国医国药,2021;32(9):2088-90.

[6]陆洁,刘静,裴天仙,等.自发性2型糖尿病模型db/db小鼠生物学特性研究[J].药物评价研究,2013;36(5):341-5.

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[9]朱叶,谢毅强,尹德辉.益智仁-乌药醚提取物对糖尿病肾病小鼠p27kip1蛋白表达的影响[J].中药药理与临床,2017;33(2):122-5.

基金资助:国家自然科学基金(81860794,81960855);海南省自然科学基金(2019RC231,821RC690);

文章来源:尹德辉,蔡飘,吴珠,等.益智仁-乌药配伍对糖尿病肾病小鼠肾小球细胞外基质的影响及作用机制[J].中国老年学杂志,2024,44(09):2127-2133.