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湖北省肾综合征出血热宿主带毒监测病毒分子进化特征研究

2024-05-13 51 上传者：管理员

摘要：目的了解湖北省肾综合征出血热(HFRS)宿主动物汉坦病毒感染状况，并对其病毒分子进行进化特征分析，为湖北省HFRS的防控提供科学依据。方法鼠肺标本用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织RNA进行巢式PCR扩增，琼脂糖电泳分析及基因测序，采用DNAstar seqman软件对测序所得序列与既往毒株基因序列进行比较，使用MegAlign软件进行同源性分析，采用MEGA11.0软件Neighbor-Joining Method构建系统进化树。结果本次调查共捕获宿主动物1 603只，优势宿主主要为黑线姬鼠663只，占比41.36%(663/1603),其次为黄胸鼠与褐家鼠共359只，占比22.40%(359/1603),为小家鼠10.42%(167/1603)。共检出汉坦病毒阳性鼠104只，鼠总体带毒率为6.49%,阳性鼠分类主要以黑线姬鼠和褐家鼠为主，分别占比44.23%(46/104)和20.19%(21/104)。病毒分子进化分析表明湖北省2022年测定的42份HTNV型病毒样本与湖北省HV004病毒株高度同源，12份SEOV型病毒株与WuhanRf02同属于一个分支和亚分支，均未显示明显的变异。结论湖北省啮齿动物带毒情况结果显示黑线姬鼠和褐家鼠带毒率较高，该地区存在感染风险。病毒分子进化稳定，尚未出现明显变异，同时应进一步加强病毒监测。

关键词：
宿主监测
汉坦病毒
流行性出血热
系统发育树
肾综合征出血热
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肾综合征出血热(Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS),又称流行性出血热。是由汉坦病毒感染引起，经鼠类等啮齿动物传播，以肾脏急性损伤为主要病理改变的自然疫源性疾病[1]。由于HFRS在中国的分布极其广泛，常见症状主要包括就是发热、头痛、腰痛、眼眶痛、以肾脏损害为主要临床表现，因此又被称为流行性出血热[2]。汉坦病毒有至少40个血清型/基因型，能引起HFRS的有7个型[3],其中汉滩型和汉城型病毒为HFRS的主要病原体[4]。汉坦病毒在环境中具有较强的生存能力，可通过接触被病毒污染的物质而传播给人类[5,6]。通过伤口接触病原体，通过鼠排泄物产生气溶胶经过呼吸道而感染，通过饮食病毒感染的水或食物而感染，通过虫媒传播、寄生虫如恙螨[7]等叮咬和母婴传播感染。病毒的传播和疫情的规模和流行度受到多种因素的影响，如人口密度、环境因素、地理位置和社会经济条件等。湖北省肾综合征出血热(HFRS)的发病率曾经占全国前10位，病死率占全国前5位[8],发病率与鼠带毒率呈正相关。因此，连续的对宿主动物监测，对病毒进行进化和宿主带毒状态的研究，有助于判断该疾病的未来趋势，对于疾病的防控具有重要意义。

1、材料与方法

1材料

1.1样本采集

标本来源于7个监测点地区，包括(十堰，荆门，荆州，黄石，咸宁，襄阳，宜昌),共计1603份，一般采用夹夜法采集宿主动物标本。在HFRS监测点进行宿主动物采集，主要是在2022年的春夏季(3-5月)和秋冬季(9-11月)各采集标本1次，采集区域包括居民区和其他野外环境。将捕获样本进行分类鉴定，并进行鼠感染情况统计，同时对鼠组织进行解剖取肺，液氮保存，送实验室进行检测。

1.2鼠肺标本处理

无菌处理鼠样本，解剖取出鼠肺组织标本，用手术剪刀剪取适量的鼠肺组织放入无菌研磨管并加入钢珠，加入一定体积的磷酸盐缓冲液，采用组织研磨仪研磨成组织匀浆。将研磨管以8 000 r/min(离心直径11 mm)离心5 min,用于后续病毒检测。

1.3主要试剂与仪器

荧光定量PCR仪(QuantStudio7 Flex)购于美国Thermo公司，组织研磨仪(TissueLyserII)购于德国Qiagen公司，台式冷冻离心机(5810R)购于德国EPPENDORF公司，全自动核酸提取仪(GeneRotex96)购于西安天隆公司，一步法病毒逆转录试剂盒(AgPath ID One-step RT-PCR KIT)购于美国Thermo公司，病毒核酸提取试剂盒(DNA/RNA提取试剂盒)购于西安天隆公司，cDNA第1链合成试剂盒(PrimeScriptTM 1stStrand cDNASynthesisKi)和DNA聚合酶(Premix Taq DNA)均购于日本TAKARA公司。

2方法

2.1病毒检测

使用天隆病毒DNA/RNA提取试剂盒提取组织RNA,加入鼠肺组织研磨后上清液200μL,按照试剂盒推荐的程序设置好提取程序上机提取组织核酸，得到50μL病毒RNA装于EP管并-80℃保存。使用汉滩型(HTNV)和汉城型(SEOV)汉坦病毒核酸检测试剂，采用双重荧光定量RT-PCR法检测汉坦病毒基因型别(双重荧光定量RT-PCR反应的引物和探针序列见表1),在96孔PCR管中配置好扩增反应所需的全部体系20μL(反应体系F(771-793) 0.5μL,F(217-237)0.5μL,R(862-884)0.5μL,R(272-291)0.5μL,P(811-893)0.25μL,P(239-263)0.25μL,2×Buffer 12.5μL,25×Enzyme 1μL,D.D.W 4μL),然后再分别加入待测样本RNA,阴性对照，阳性对照各5μL,设定好扩增参数。扩增条件50℃30 min; 95℃5 min; 95℃15 s,共45个循环；55℃30 s。每个循环结束后同时检测FAM和VIC通道荧光信号。使用实时荧光定量RT-PCR法对样本进行检测。

表1双重荧光RT-PCR反应的引物和探针序列

2.2 M片段RT-PCR扩增

根据《全国肾综合征出血热监测方案》[9],采用巢式PCR法分两轮扩增M片段部分序列，扩增HTNV和SEOV型汉坦病毒的引物序列见表2。过程按照TAKARA PrimeScript 1stStrand cDNASynthesisKit试剂盒说明书进行，以提取好的RNA为模板采用随机引物进行逆转录反应合成cDNA第一条链，先进行第一轮扩增。参考2.1反应条件，再以第1轮扩增反应产物为模板，分别用HTNV、SEOV型汉坦病毒巢式PCR特异性引物作为巢式内侧引物进行第二轮扩增，扩增条件同一轮。取5μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，于含溴化乙锭(EB)的琼脂糖凝胶上电泳30 min,在紫外线透射仪下观察。

表2巢式PCR法扩增用引物序列

2.3基因测序及构建系统发育树

将第二轮PCR扩增反应产物送武汉天一辉远生物科技有限公司进行DNA测序。构建系统发育树从GenBank上下载HTNV和SEOV标准株、湖北和其他地区毒株，使用DNAstar seqman程序针对与扩增片段位置相同的M片段部分基因进行序列比对，使用MegAlign软件进行同源性分析，使用MEGA11.0软件Neighbor-Joining Method构建系统进化树。

2、结果

1宿主动物监测概况

各监测点共捕鼠1 603只，平均鼠密度0.43%(表3),分别为白腹巨鼠1只，褐家鼠359只，黑线仓鼠1只，黑线姬鼠663只，黄毛鼠16只，黄胸鼠359只，社鼠17只，小家鼠167只，鼩鼱类8只，其他12只。其中室内捕鼠304只，鼠密度0.11%。野外捕鼠1 299只，鼠密度0.33%。湖北省优势宿主主要为黑线姬鼠，黄胸鼠，褐家鼠和小家鼠，其中黑线姬鼠663只，占比41.36%(663/1603),其次为黄胸鼠与褐家鼠为359只，占比22.40%(359/1603),最后为小家鼠10.42%(167/1603)。

表3宿主动物标本采集情况表

2鼠类携带病毒情况

对1 603份鼠肺组织标本进行病毒核酸检测，结果总体感染率6.49%(104/1603),其中感染的鼠类分别为黑线姬鼠46只，褐家鼠21只，黄胸鼠15只，小家7只，社鼠4只，鼩鼱类4只，白腹巨鼠1只，其他6只。各地区的宿主动物汉坦病毒阳性率中，最高为咸宁19.00%(38/200)。在居民区和野外捕捉的样本中，居民区和野外区宿主动物汉坦病毒感染率分别为8.49%(18/212),6.18%(86/1391);居民区鼠种感染率中占比黑线姬鼠33.33%(1/3),褐家鼠6.94%(5/72),黄胸鼠18.87%(10/53),小家鼠1.20%(1/83),鼩鼱类100.00 %(1/1);野外区黑线姬鼠6.67%(44/660),褐家鼠5.57%(16/287),黄胸鼠1.62%(5/308),小家鼠7.14%(6/84),社鼠23.53%(4/17)白腹巨鼠100.00%(1/1),鼩鼱类42.86%(3/7),其他50.00%(6/12)(表4)。

表4不同种属宿主动物携带病毒情况表

表5不同地区宿主动物与病毒携带情况

3病毒M片段的琼脂糖凝胶电泳分析图

将巢式PCR第二轮扩增的PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，结果在418bp位置处有一特异扩增条带，片段大小和预期相符(图1)。

4病毒分子进化分析

4.1 HTNV型病毒的分子进化分析

对PCR扩增产物进行测序分析，构建系统发生树，表明HTNV型汉坦病毒和SEOV型汉坦病毒在进化上分别处于两个明显的进化分支。其中有42份样本的基因测序分型为HTNV型，进化树见图2。

图1病毒部分M片段的琼脂糖凝胶电泳图

M DL2000 DNA Marker 1～7第二轮扩增产物

图2 HTNV型汉坦病毒的分子进化树图

4.2 SEOV型病毒的分子进化分析

DNA测序结果表明，湖北省2022年的样本63、66、67、68、70、75、78、80、81、82、89、91基因测序分型为SEOV型，分子进化树见图3。

图3 SEOV型汉坦病毒的分子进化树图

3、讨论

肾综合征出血热是一种由汉坦病毒等引起的急性传染病。该疾病是主要通过啮齿动物传播[10]发病率与鼠带毒率密切相关。湖北省自1957年有病例之后，每年都有报告。80年代到达顶峰，2003年之后呈现逐年下降的平稳趋势，2015年之后情况变得缓慢，呈现局部波动状态，2017年呈上升趋势[11]。2021年，湖北省肾综合征出血热(HFRS)的发病率占全国前10位，病死率占全国前5位[8]。

通过对1 603只宿主动物进行监测，分析鼠类携带汉坦病毒的感染情况，并对病毒M片段进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果表明，湖北省优势宿主为黑线姬鼠、黄胸鼠、褐家鼠和小家鼠，与历年样本特征一致[12]。病毒核酸检测显示，总体感染率为6.49%,其中黑线姬鼠、褐家鼠、黄胸鼠和小家鼠感染率较高，优势宿主中黑线姬鼠带毒率为6.94%,褐家鼠带毒率为5.85%。由于传染源存在差异，导致不同地区和不同宿主之间可能存在差异性[13],咸宁，襄阳，荆州，荆门检测出两种型别，十堰为SEOV型。其中荆州市HFRS疫情处于较高水平与鼠活动密切相关[14]。但在宜昌和黄石未检出，可能是样本的采集存在采样误差也可能该地区既往流行水平较低。环境因素，气候等对病毒的传播和宿主数量有显著影响[15,16]。

本研究中有42份样本的基因测序分型为HTNV型(详细见图2),上述42份鼠肺样本中的病毒同近年来湖北省武汉市的Caidian HTV_3、Caidian HTV-6和HV004、Hubei Hu02、WuhanAaJ10同属于一个分支和亚分支，亲缘关系最近，表明湖北省近年来HTNV型汉坦病毒在分子进化上未发生明显，均与湖北省优势株HV004高度同源。但上述病毒同我国北京、浙江、贵州等省份的HTNV型汉坦病毒84FLi、Bao14、84FLi、Hantaanvirus Z10、Hantaanvirus CJAa2等的亲缘关系较远，不属于同一亚分支。

样本63、66、67、68、70、75、78、80、81、82、89、91基因测序分型为SEOV型，上述12份鼠肺样本中的病毒同近年来湖北省武汉市的WuhanRf02同属于一个分支和亚分支，亲缘关系最近。上述病毒同我国江西、河南、吉林、北京等省份的SEOV型汉坦病毒JiangxiXinjiangRn-07-2011、26M-2014Henan、Gongzhuling58、XiaotangshanRn7等亲缘关系较近，与武汉市的WuhanRf02同属于一个分支和亚分支，未显示出明显的变异，提示与既往本省的汉坦病毒株相比，病毒变异程度较小，保持相对稳定。

本研究仅对湖北省部分地区的宿主动物进行了监测，未来还需扩大监测范围，以更全面地了解汉坦病毒在湖北省的流行情况和分子进化特征。同时，针对不同地区的病毒感染情况和宿主分布，制定针对性的防治措施，降低汉坦病毒引发的疾病风险。

随着人们生活水平的提高，个人防护意识的不断加强，环境卫生的加强，防鼠灭鼠等措施的实施，疫苗的接种工作和媒体的宣传与教育活动的开展，以至于人们接触野生动物的机会大大减少，进一步减少疾病的感染。

综上所述，肾综合征出血热宿主带毒监测是一项必要且重要的基础性工作，可以提供有关疾病传播方式、宿主动物的分布情况以及人群感染的风险评估等信息。通过有效的监测和控制措施，可以更好地预防和控制这种疾病的传播并保障人民的健康和安全。

参考文献:

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[4]张琼娜,段春丽,张绍琼,等.2009-2019年祥云县流行性出血热流行特征分析[J].国际病毒学杂志,2021,28(1):28-31.

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[12]刘婧.湖北地区汉坦病毒与宿主的基因进化研究[D].武汉大学,2011.