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葡萄糖转运蛋白3在噪声诱导听觉损害中的作用研究

2025-02-11 52 上传者：管理员

摘要：目的探索葡萄糖转运蛋白3(glucose transporter 3,Glut3)在噪声暴露后不同时间点表达量变化。方法选取C57BL/6J小鼠，随机分为对照组10只和噪声暴露(noise exposure,NE)组18只。对照组小鼠采用Western blot检测、耳蜗中轴冷冻切片、耳蜗基底膜铺片及免疫荧光染色来明确耳蜗中Glut3表达以及定位。噪声暴露组小鼠给予白噪声115 dB SPL暴露4 h，构建永久性阈值偏移模型(permanent threshold shift,PTS)小鼠。对该组其中12只小鼠进行噪声暴露后即刻、1 h和24 h取材，每组4只，进行耳蜗基底膜铺片及免疫荧光染色观察Glut3表达量是否发生变化。对该组其余6只小鼠在噪声暴露后第7、14、21和28d进行听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)检测，来确保造模成功。结果 Glut3在耳蜗组织中广泛表达。与对照组相比，噪声后即刻取材组Glut3表达量明显升高，具有统计学意义(P<0.05)，而噪声后1 h组和24 h组Glut3荧光表达量无明显变化(P>0.05)。结论 Glut3在噪声后即刻表达明显升高，对噪声发挥快速应答和能量补充作用。

关键词：
发病率
听觉损害
噪声性耳聋
耳蜗
葡萄糖转运蛋白Glut3
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噪声性耳聋(noise-induced hearing loss，NIHL)的发病率逐年上升，已成为国内外听觉研究领域中具有挑战性的问题[1]。长期暴露在噪声环境下可发生多种病理变化，如毛细胞凋亡[2]、耳蜗带状突触丢失[3-4]和听神经损伤[5]等，这些都与大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)聚集相关[6]。线粒体是ROS的主要来源[7]，噪声刺激可导致线粒体功能障碍，导致耳蜗组织腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate，ATP)减少和能量供应不足[8-9]。Glut3是葡萄糖转运蛋白家族(Gluts)的一员，该家族是由SLC2 (solute carrier family 2)基因编码的负责维持血糖水平稳定的重要调节因子[10]。该家族由14个亚型(Glut1-Glut14)组成，每个亚型都有特定的组织表达[11]。Glut3广泛表达于中枢神经系统(central nervous system，CNS)、脑实质细胞和肿瘤细胞中[12-13]。在中枢神经系统中，Glut3在短暂的谷氨酸兴奋性毒性中发挥神经保护作用。也有研究表明耳蜗组织中表达Glut1和Glut3[14-15]两种亚型，两者共同协调内耳的血糖稳定，而Glut3对毛细胞的糖代谢调控更为重要[14]。然而Glut3在听觉病理状态如NIHL的具体作用尚不明确。因此，本研究构建了噪声导致永久性听力下降鼠模型，分析Glut3在噪声性耳聋中的作用及分子机制，为噪声性耳聋的发生和防治提供分子基础。

1、材料与方法

1.1实验动物与分组

选取6~8周龄C57BL/6J雄性小鼠，均购自北京斯贝福生物技术有限公司，实验动物合格证编号：No.110324241103906356。饲养于首都医科大学实验动物中心，实验动物许可证编号：[SCXK(京)2024-0001]。将小鼠随机分为对照组10只和噪声暴露组18只。对照组小鼠进行Westernblot检测(3只)、耳蜗中轴冷冻切片(3只)、耳蜗基底膜铺片(4只)及免疫荧光染色来明确耳蜗中Glut3表达以及定位。噪声暴露组小鼠进行白噪声、115 dBSPL、4 h造模构建永久性阈值偏移模型(permanentthreshold shift，PTS)小鼠。对该组其中12只小鼠进行噪声后即刻、1 h和24 h取材，每组4只，进行耳蜗基底膜铺片及免疫荧光染色观察Glut3表达量是否发生变化。对该组其余6只小鼠在噪声造模后第7、14、21和28 d进行听性脑干反应(auditory brainstemresponse，ABR)检测，来确保造模成功。所有动物实验经首都医科大学动物伦理委员会批准(AEEI-2024-206)，动物福利遵照《实验动物护理和使用指南》执行。

1.2听力测试

采用听觉脑干反应(auditory brainstem response，ABR)对小鼠听力进行测定。具体实验流程为：用100 mg/kg氯胺酮腹腔注射将小鼠麻醉后，放置于隔音室内，用美国TDT RZ6机器进行检测，将ABR记录电极置于小鼠前颅顶正中，将参考电极和接地电极分别插入测试耳及对侧耳耳后皮下，给声喇叭置于测试耳的外耳道内。ABR刺激声选用短声(click，100μs)和短纯音(4，8，16，24 kHz，100μs)。刺激强度从90 dB SPL开始，以10 dB逐渐递减，接近阈值时以5 dB逐渐递减，直至没有听力波形，以能分辨出可重复的ABR波Ⅱ的最低刺激强度判断ABR阈值。

1.3噪声暴露

对ABR听力初筛后听力正常的小鼠进行噪声暴露。本实验采用Cool Edit Pro软件合成白噪声，放大后通过扬声器播放白噪声音频，声级计测量噪声强度115 dB SPL，刺激时长4 h。噪声组小鼠置于独立的钢丝网中限制其自由活动，鼠笼置于两个音响正中。在噪声完成后第7、14、21和28 d进行ABR听力检测，以确保造模成功。

1.4耳蜗基底膜组织铺片采用颈椎脱位法处死小鼠，取出耳蜗，首先用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，于显微镜下清理耳蜗周围肌肉，在蜗顶及圆窗打孔，将耳蜗标本置于4%(体积分数)多聚甲醛中于4℃冰箱过夜固定，第二天在室温下，用10% (体积分数)乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙液处理耳蜗标本2 h，之后于显微镜下去除蜗壳、血管纹、外侧壁、前庭膜和盖膜等组织。最后在PBS中将基底膜分为顶回、中回和底回三段，浸泡在PBS中，进行后续免疫荧光染色。

1.5耳蜗中轴冰冻切片

将用4%(体积分数)多聚甲醛固定后的耳蜗放置在EDTA中脱钙12 h，之后移至于15%(质量分数)蔗糖溶液中脱水2 h，再移至于30%(质量分数)蔗糖溶液中脱水2 h，然后OCT(Tissue-Tek)包埋在4℃冰箱过夜。第二将OCT包埋过的耳蜗标本移至低温-20℃切片机内(Leica)，待耳蜗标本冷冻后，平行于耳蜗轴线连续切成厚度为10μm的薄片，进行后续免疫荧光染色。

1.6免疫荧光染色

上述准备好的标本用0.3% TritonX-100和5%山羊血清中室温孵育2 h，用PBS清洗3次后置于一抗，4℃ 过夜，第二天再次用PBS清洗3次后放置于相对应的二抗，室温避光2 h后，洗去二抗，用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封固，将制备好的片避光保存。本研究主要使用的抗体有：鼠抗Glut3抗体(1∶300)，兔抗Myosin VIIa抗体(1∶300)。羊抗兔IgG/Alexa Fluor 647(1∶300)，羊抗鼠IgG/Alexa Fluor 488(1∶300)。制备好的标本于高分辨率共聚焦显微镜(Leica、德国)层扫，激发波长分别为488 nm(绿)、568 nm(红)。DAPI激发波长为358 nm(蓝)。自上至下扫描，叠加图像。

1.7 Western blot检测

在干净且干燥的耳蜗组织中加入100μL细胞裂解液，冰浴混合30 min。之后于4℃离心机离心20 min后，吸取上清液作为总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒(G2026，Servicebio)测定蛋白浓度。在上清液中根据50∶1的比例加入上样缓冲液，95℃水浴锅煮沸蛋白10 min。每孔道20μL蛋白上样，电泳电压120 V (1.5~2 h)，电转电流250 mA(1 h)。结束后，将膜取出，脱脂奶粉封闭1 h后进行抗体孵育，一抗4℃冰箱摇床上孵育过夜。TBST清洗3次，孵育相应二抗室温1.5 h后加入ECL显色液显示蛋白条带。

1.8统计学方法

本研究使用GraphPad Prism 9.2统计软件对数据进行处理和分析。正态分布测量数据以均数±标准差(x±s)表示。多组间比较采用two-way ANOVA分析，两两比较采用t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。荧光强度统计用ImageJ进行定量分析，每张图像使用相同的尺寸和参数以确保准确性。

2、结果

2.1 Glut3在成年野生耳蜗中的定位表达

①通过Western blot检测成年小鼠耳蜗Glut3蛋白条带，采用β-actin作为内参蛋白。(n=3)；②Glut3在成年小鼠耳蜗的表达；③Glut3在小鼠螺旋神经节(spiralganglion，SGN)细胞的表达；④Glut3在小鼠毛细胞(hair cells，HCs)的表达；⑤Glut3在小鼠血管纹(stria vascularis，SV)中的表达。比例尺：250μm。(n=3)

图1成年小鼠耳蜗中Glut3的表达和定位

图2内、外毛细胞中Glut3的表达定位

为了明确Glut3在内耳中表达，对成年小鼠耳蜗进行Western blot检测。明确Glut3表型在耳蜗组织表达后，对全耳蜗进行中轴冰冻切片及免疫荧光染色观察Glut3在耳蜗中的定位。染色结果显示，Glut3在耳蜗中广泛表达，血管纹(stria vascularis，SV)，螺旋神经节(spiral ganglion，SGN)和毛细胞(Hair cells，HCs)中均有Glut3荧光阳性信号(图1)。这表明Glut3对协调内耳葡萄糖稳定极为重要。

2.2 Glut3在内、外毛细胞中的定位表达

为了进一步明确Glut3在内、外毛细胞中的表达情况，对成年小鼠耳蜗基底膜进行铺片及免疫荧光染色，我们观察到Glut3阳性信号在耳蜗的顶回和中回更为明显，而在底回表达较低。在外毛细胞区域，Glut3均匀表达在细胞中。而在内毛细胞区域，Glut3荧光信号在其底部尤其丰富，这与内毛细胞底部释放大量带状突触，促进神经连接，因此需要更多的能量支持相一致(图2)。

2.3噪声后ABR听力检测

噪声性耳聋通常分为两种类型。永久性阈值偏移(permanent threshold shift，PTS)是指长期暴露于噪声刺激下所引起的不可逆的听力损伤。暂时性阈值偏移(transient threshold shift，TTS)指听阈在强噪声环境中暴露后短暂地升高，而离开噪声环境听阈得到恢复的现象。我们要明确的是Glut3在不可逆性听力下降中的表型。对115 dB白噪声刺激后第7、14、21和28 d的ABR听力阈值进行分析(图3①)。上述时间点阈值均明显高于对照组，随着时间的延长，阈值有恢复趋势，但在第28 d时，阈值仍明显高于对照组，未达到正常听力水平(图3②)。

2.4噪声后不同时间点Glut3表达量变化

为研究耳蜗毛细胞中的Glut3在噪声刺激时发挥何种作用，取噪声后即刻组(NE)、噪声后1 h组(NE 1H)和24 h组(NE 24H)进行研究。对以上不同时间点耳蜗基底膜组织铺片及免疫荧光染色。在共聚焦采图过程中，我们控制了每组拍摄条件一致，以确保Glut3的荧光强度代表其表达水平，并将荧光强度进行量化统计。与对照组相比，Glut3的荧光强度在NE组的顶回和中回明显增加(图4①)。且具有显著统计学意义(P<0.01，图4②)。而底回未见明显变化。Glut3的表达水平在NE后1H组和24H组无明显变化。

图3噪声后不同时间点ABR听力阈值变化

图4 Glut3表达量在噪声暴露后不同时间点的变化

3、讨论

噪声性耳聋已成为影响人们健康生活的严重疾病[16]。目前，噪声性耳聋的主要分子机制为两大主流学说：氧化抗氧化失衡[17]和谷氨酸兴奋性毒性[18]。而氧化抗氧化失衡为最基础的分子机制[19]。在遭受噪声刺激时，线粒体功能障碍，有氧呼吸减弱，无氧呼吸增强，导致大量ROS聚集，从而发生后续系列病理变化[20]。即适当的能量代谢代偿对防止噪声致聋极为重要。葡萄糖是机体供能的主要物质，通过有氧呼吸和无氧呼吸转化为ATP，直接为细胞活动提供能量[21]。生理状态下，有氧、无氧呼吸相互协作，共同供能[22]。病理状态下，细胞有氧呼吸受损，此时负责转运葡萄糖的关键蛋白发挥重要作用，促进胞外葡萄糖转运至细胞内，加快无氧呼吸速率，补偿能量供应[21，23-24]。其家族成员之一的Glut3主要在中枢神经系统、脑实质细胞、耳蜗毛细胞处发挥此能量代偿作用。Weisova等[25]发现Glut3在中枢神经系统发挥快速能量调控作用，在谷氨酸兴奋性毒性暴露30 min内，Glut3迅速促进葡萄糖从胞外转运至胞内，增加糖酵解过程以产生更多ATP供能，从而发挥神经保护作用。Huerzeler等[14-15]发现耳蜗组织表达Glut3亚型，且对平衡毛细胞血糖稳态发挥重要作用。但目前尚未有研究表明Glut3在听觉病理模型中的变化。则本研究重点探索听觉病理—噪声致聋过程中耳蜗毛细胞的Glut3表达量的变化及其作用。本研究选择用白噪声构建PTS鼠模型，选取噪声后即刻、1 h和24 h三个时间点来探索Glut3的变化以及是否具有快速能量补充作用。我们发现Glut3仅在噪声刺激后即刻表达升高到峰点，然后快速恢复。这与其在中枢中发挥快速能量调控作用相一致，极短的时间内发挥作用。这是因为噪声刺激时，耳蜗毛细胞需要极多能量支持来应对白噪声带来的冲击，而此时线粒体功能障碍，导致有氧呼吸产生ATP相对减少[26]，这时将会出现代偿供能，即激活极多的Glut3发挥快速能量调节作用，增加毛细胞内葡萄糖转运以及无氧呼吸活动，以产生足够ATP支持细胞活动。而针对噪声性耳聋的另一分子机制谷氨酸兴奋性毒性，在遭受噪声刺激时，会过度激活耳蜗内毛细胞突触前膜释放过多的谷氨酸，谷氨酸—谷氨酞胺循环失调，导致谷氨酸在突触间隙大量堆积，造成兴奋性毒性[27]。在中枢神经元中，短暂谷氨酸兴奋性毒性激活AMPK(5，-adenosine monophosphateactivated protein kinase)信号通路上调Glut3表达，从而发挥神经元保护作用[25]。我们的研究显示Glut3在耳蜗内毛细胞底部表达较为丰富，而在听觉生理中，内毛细胞底部释放耳蜗带状突触，促进大量听神经连接，即Glut3的生理定位表明在建立神经连接过程中发挥重要作用。噪声刺激时，内毛细胞底部过度释放耳蜗带状突触需要大量ATP供能，Glut3被激活发挥代偿供能作用。我们的研究结果显示噪声后即刻组内毛细胞底部的Glut3表达量的确升高。然而，对于Glut3在此过程中如何发挥作用以及是否在噪声性耳聋中发挥听神经保护作用等仍需进一部探索。综上，我们的研究表明，Glut3对噪声发挥快速应答以补充部分能量，而生理状态下的Glut3含量不足以完全抵抗持续强烈的噪声刺激，这可能为后续噪声致聋病理变化的分子基础。本研究可为噪声性耳聋提供新的分子机制和治疗靶点，然而对于调控该蛋白的信号通路还需进一步探索，以及调控该通路对噪声引起的听力下降是否发挥积极治疗作用仍需探索。

基金资助:国家自然科学基金项目(82371151,82071037,82301298);北京市科委-教委联合基金项目(KZ20231002542);首都医学科学创新中心科研培育项目资助(CX24PY14);

文章来源:李重慧,郭瑞,龚树生,等.葡萄糖转运蛋白3在噪声诱导听觉损害中的作用研究[J].中华耳科学杂志,2025,23(01):95-100.