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肺炎克雷伯菌毒力基因检测及peg-344的诊断效能研究

2025-04-18 80 上传者：管理员

摘要：目的探讨临床分离的肺炎克雷伯菌(KPN)毒力基因分布及peg-344对高毒力菌株的诊断效能｡方法收集2023年1-12月首都医科大学宣武医院分离的KPN菌株,采用Whonet5.6分析菌株分布及耐药情况,毒力检测包括拉丝试验､PCR扩增毒力基因(peg-344､rmpA､iutA､iroB)和K1､K2荚膜血清型､血清抗性试验,采用受试者工作特征曲线分析诊断效能｡结果收集的122株KPN菌株中敏感菌45株(36.9%)､超广谱β-内酰胺酶阳性菌20株(16.4%)､碳青霉烯耐药菌57株(46.7%);标本主要分离自痰液､尿液和血液,主要来源于泌尿外科､神经内科､重症监护室和神经外科;拉丝试验阳性率27.9%,PCR检出毒力基因K1(12.3%)､K2(8.2%)､peg-344(62.3%)､rmpA(60.7%)和iutA(73.8%),iroB阴性,同时检出多种毒力基因菌占63.1%;血清抗性试验1~2级､3~4级和5~6级菌株分别占43.5%､31.1%和25.4%;peg-344诊断高毒力菌株的曲线下面积最大,其次为peg-344+iutA和peg-344+rmpA｡结论该院KPN分布广泛,存在多种毒力基因,peg-344对区分低毒力株和高毒力株有一定临床价值｡

关键词：
peg-344
毒力基因
诊断效能
高毒力肺炎克雷伯菌
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高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)被认为是经典肺炎克雷伯菌(KPN)的新变异,自1986年首次报道以来,全球均有相关流行报道[1],尤以我国检出率最高[2],因其感染进展迅速,患者预后差,病死率高,引起了广泛关注｡近年来耐碳青霉烯的HvKP(CR-HvKP)陆续被报道[3-4],高耐药和高毒力的双重压力下临床抗感染和治疗所面临的挑战再次升级｡因此,早期诊断HvKP对改善患者预后尤为必要｡动物实验为确认HvKP的金标准,但临床实验室无法常规开展,共识指出毒力基因检测更准确,其中内膜转运蛋白编码基因peg-344､iroB､iucA和rmpA/A2对鉴别HvKP有较好价值[5]｡因不同地区流行的HvKP株及所携带毒力基因存在较大差异[6],因此,本研究拟分析本院KPN毒力基因分布情况并探究peg-344对HvKP的诊断能力,为临床及时准确判断其感染提供参考｡

1、资料与方法

1.1一般资料

收集首都医科大学宣武医院2023年1-12月住院患者各类临床标本中分离的非重复KPN,保留同一患者不同部位分离菌株｡药敏质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922,低毒力参考菌为KPNATCC700603(拉丝试验和毒力基因结果均阴性),高毒力参考菌为HvKPNTUH-K2044(拉丝试验和毒力基因结果均阳性)｡本研究符合《赫尔辛基宣言》原则和首都医科大学宣武医院相关规定(临研审2020052号),患者免知情同意｡

1.2仪器与试剂

2×DirPCRMasterMix､DL2000Marker､核酸染料､50×TAE缓冲液(北京索莱宝科技有限公司),Agarose琼脂糖(BBI生命科学公司),血琼脂平板､M-H平板(赛默飞世尔生物化学制品有限公司),引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成｡电泳仪(北京六一仪器厂),基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)仪(德国布鲁克公司),VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统及配套ASTGN334药敏卡片(法国生物梅里埃公司),聚合酶链反应(PCR)扩增仪(美国BIO-RAD公司),U-henins型凝胶成像分析系统(英国Syngene公司)｡

1.3方法

1.3.1菌株鉴定与药敏试验

入选菌株复苏后接种于哥伦比亚血琼脂,35℃过夜培养后分离单个菌落,细菌鉴定采用MALDI-TOFMS仪完成｡药敏试验采用VITEK2Compact全自动微生物鉴定系统及配套ASTGN334药敏卡片,敏感性参考标准为美国临床实验室标准化协会(CLSI)2021[7]｡1.3.2拉丝试验用接种环挑起血平板上35℃生长18h的单个菌落,观察是否拉丝,拉丝长度≥5mm判为拉丝试验结果阳性,反之为阴性｡

1.3.3PCR检测扩增毒力基因

加热煮沸法提取细菌DNA,参照文献[8]合成毒力基因引物,见表1,扩增体系25μL,PCR扩增反应条件:95℃2min预变性,之后95℃30s,53~58℃30s,72℃40s,72℃10min延伸,共30个循环｡扩增产物用1%凝胶电泳,紫外成像分析并拍照｡

表1毒力基因检测引物序列

1.3.4血清抗性试验

参考文献[9]取单个菌株接种到灭菌LB肉汤培养基中,37℃200r/min振荡培养16h,调菌液浓度至1×106CFU/mL;取150μL新鲜健康成人血清与上述菌液50μL于灭菌EP管内,振荡培养(37℃200r/min)3h,分别在0､1､2､3h将细菌血清混合液10倍稀释后取10μL于MH平板上转种,测定细菌数量进行活菌计数｡比较每个时间点的菌落总数确定血清抗性试验结果｡

1.3.5HvKP毒力判定

本研究中血清抗性试验以HvKPNTUH-K2044(血清抗性试验结果为3~6级)作为毒力阳性对照,KPNATCC700603血清抗性试验结果为1~2级作为毒力阴性对照｡以血清抗性试验结果3~6级判定为高毒力组,血清抗性试验1~2级为低毒力组[10]｡

1.4统计学处理

采用SPSS27.0进行数据分析,计数资料用频数或百分率表示,两组间比较采用χ2检验,绘制受试者工作特征(ROC)曲线,以曲线下面积(AUC)评估毒力基因及毒力基因组合诊断HvKP的效能｡P<0.05为差异有统计学意义｡

2、结果

2.1菌株信息

共收集非重复毒力基因结果阳性与荚膜血清型基因结果阳性KPN菌株122株,分离自男86例,女36例,年龄4~95岁,平均(58.1±18.1)岁,>60岁占45.9%｡标本主要来源为痰液(59株,48.4%)､血液(26株,21.3%)､尿液(15株,12.3%)和引流液(6株,5.0%)｡临床科室分布前5位为神经内科(26株,21.3%)､神经外科(20株,16.4%)､重症监护室(16株,13.1%)､泌尿外科(15株,12.3%)和普通外科(11株,9.0%)｡药敏试验结果显示敏感菌45株(36.9%),超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)阳性菌20株(16.4%),耐碳青霉烯类KPN(CRKP)57株(46.7%)｡2.2拉丝试验及毒力基因结果122株KPN中,拉丝试验结果阳性34株(27.9%)｡荚膜血清型K1型和K2型阳性分别为15株(12.3%)和10株(8.2%);毒力基因iutA､peg-344和rmpA阳性分别为90株(73.8%)､76株(62.3%)､74株(60.7%),未检出iroB｡见表2､图1｡

表2122株KPN毒力基因检测结果

2.3血清抗性试验结果及与毒力基因的关系

结果显示,血清抗性试验结果1~2级､3~4级和5~6级分别有53株(43.5%)､38株(31.1%)和31株(25.4%)｡荚膜血清型K1和K2阳性HvKP菌株血清抗性均≥3级,血清抗性≥3级菌株表现为高毒力的共检出69株(56.5%)｡低毒力组与高毒力组同一毒力基因或不同基因组合分布差别有统计学意义(P<0.001)｡低毒力组中iutA与其他单个毒力基因或基因组合阳性率比较差别有统计学意义(P<0.05)｡见表3｡

图1毒力基因结果

2.4毒力基因及毒力基因组合的诊断效能分析

单个毒力基因中peg-344诊断HvKP的灵敏度､特异度均较高(84.1%､66.0%),其次为rmpA(81.2%､66.0%),iutA灵敏度最高(89.9%),特异度最低(47.2%),peg344+rmpA+iutA毒力基因组合诊断HvKP的阳性预测值最高(91.4%),特异度最高(76.8%)｡peg-344诊断HvKP的AUC最大(0.783),其次是peg-344+iutA(0.770)和peg-344+rmpA(0.770)｡见表4｡

表3122株KPN毒力基因分布与血清抗性试验结果的关系

表4不同毒力基因HvKP的效能

3、讨论

HvKP较cKP更易引发严重侵袭性和播散性感染,进展迅速,预后差,病死率极高,已引起全球广泛关注[11]｡有研究发现,KL64型的CRKP菌株可通过毒性质粒水平转移获得毒力基因,而rmpA､rmpA2和peg-344毒力基因可进一步增强致病力呈现高毒力高耐药表型,临床抗感染和治疗面临极大挑战,因此,早期诊断HvKP迫在眉睫[12]｡本研究结果显示,临床分离的KPN临床分布以神经内科､神经外科､重症监护室和泌尿外科为主,60岁以上患者占45.9%,考虑这与首都医科大学宣武医院肾移植患者增多有关,其术后服用免疫抑制剂､手术创伤均为感染的高危因素,患者大多免疫力低下,常伴有多种基础性疾病､气管插管等有创操作及使用呼吸机,使HvKP感染机会增加｡

毒力基因和表型是临床常用的检测HvKP和评估毒力的方法,目前尚未有判断高毒力菌株的金标准｡既往用拉丝试验判断高毒力表型,但该方法判断毒力并不确切,本研究中拉丝试验结果阳性率仅为14.8%｡随着测序技术的进步,更多的毒力基因被发现,有研究显示,荚膜多糖､铁载体等在HvKP致病性中起重要作用[5],如rmpA基因可正向调控荚膜生成,占细菌总铁载体活性90%的气杆菌素由iucAB-CD操纵子编码,其同源受体由iutA基因编码,peg-344位于毒力质粒参与肺部感染,荚膜血清型K1和K2型是HvKP的主要型别等[13]｡既往研究均建立各自的标准判断HvKP,各地HvKP阳性率有很大差异,如以气杆菌素基因为标准,我国武汉HvKP阳性率高达73.9%,而浙江阳性率仅为8.3%[6,14]｡本研究iutA､peg-344和rmpA阳性率分别为73.8%､62.3%､60.7%｡可见,毒力基因的分布及同一毒力基因的阳性率在不同城市呈现地域差异性｡因此,通过毒力基因准确识别HvKP仍需进一步研究｡此外,有研究发现,iroBCDN的缺失并不能降低毒力反而可能增强CR-HvKP在巨噬细胞中的存活能力[15]｡

动物实验是判断HvKP的金标准,但目前因操作复杂及伦理因素等原因而仅用于科研,其他可用于检测HvKP的体外试验包括血清抗性试验､中性粒细胞抗吞噬试验等｡血清抗性试验操作相对简便且成本低,虽然存在缺点,部分学者认可程度不一,但该试验仍可作为毒力检测的参考｡本研究荚膜血清型K1和K2阳性HvKP菌株血清抗性试验3~6级,以血清抗性试验判断毒力高低,并对不同毒力表型菌株的毒力基因分布分析,发现低毒力组与高毒力组同一毒力基因或不同基因组合分布差别有统计学意义(P<0.001)｡检测HvKP是判断播散性感染致病原因的常见手段,本研究选择5种毒力基因及其组合进行诊断效能的评价,结果发现,peg-344在诊断HvKP方面的效能最高,其次是peg-344+iutA和peg-344+rmpA组合｡本研究peg-344+rmpA+iutA毒力基因组合诊断的阳性预测值最高(91.4%),单个毒力基因中peg-344灵敏度､特异度最高,与既往研究发现用peg-344+iroB+iucA+rmpA/A2联合诊断HvKP的灵敏度和特异度高的结果相似[16]｡本研究发现peg-344与rmpA二者阳性重叠率高,但peg-344检出率略高于rmpA,综合比较peg-344对区分低毒力和中高毒力有一定的临床价值｡特别是现阶段CR-hvKP感染呈上升趋势,因此其对临床早期诊断治疗具有重要意义｡但本研究仍有不足需进一步完善,如未能进行小鼠感染模型实验,以及更全面的毒力基因和荚膜血清型检测｡

综上所述,首都医科大学宣武医院KPN在临床分布广泛,尤以泌尿外科､神经内外科､重症监护室为主,老年人占比高;HvKP存在多种毒力基因,其中peg-344对诊断HvKP有一定临床价值,灵敏度和特异度较其他毒力基因高,具有较高的诊断效能｡

参考文献:

[5]中国老年医学会检验医学分会,上海市医学会检验医学专科分会,海市微生物学会临床微生物学专业委员会.高毒力肺炎克雷伯菌实验室检测专家共识[J].中华检验医学杂志,2023,46(11):1164-1172.

基金资助:高层次公共卫生技术人才建设项目(学科骨干-01-023);

文章来源:杨文硕,居乐阳,陈典典,等.肺炎克雷伯菌毒力基因检测及peg-344的诊断效能研究[J].国际检验医学杂志,2025,46(07):769-772+779.