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临床实验室检测乙型肝炎病毒表面抗原的方法学关联及效能分析

2025-07-26 73 上传者：管理员

摘要：目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）表面抗原（HBsAg）在临床实验室不同检测系统之间存在的关联及检测效能分析，进而对检测结果进行科学合理的解读，使临床实验室更好地服务于临床。方法：收集南阳市中心医院2021年6月至2022年7月期间，临床科室（感染肝病科为主）送检的筛查、疑似及确诊HBV感染患者标本100425例，检测方法学为HBsAg定量（电化学发光法和化学发光法）、定性（金标法）、半定量（ELISA法）和高灵敏HBV-DNA（RT-PCR法），分析各方法学之间的优劣及密切程度。罗氏HBsAg两套检测系统之间存在的关系采用相关分析方法。HBsAg效能分析采用Cut/Off值设定和检出限验证，进而分析假阳性和假阴性报告模型的分布。结果：低浓度和中浓度HBsAg的检测结果在电化学发光半定量法与ELISA法之间有相关性。ELISA法检测HBsAg在灵敏度和特异度方面仍具有检测优势，与国内外HBsAg定量检测系统相比无显著差异。依据CNAS-GL038文件进行性能验证显示，本实验室ELISA法检测HBsAg计算所得HBsAg最低检出限至0.1U/ml,ROC曲线设定Cut/Off值=0.105时，曲线下面积最大（AUC=0.986）。以罗氏电化学发光半定量检测和患者病史为依据，ELISA法检测HBsAg假阳性的发生例数在乙肝五项常见报告模型中，以单独HBsAg阳性出现的频次最高，HBsAg在OD值小于0.5区间内出现假阳性频次最高。在ELISA法检测HBsAg报告阴性结果中，随着OD值由0.01到0.10逐渐增大，假阴性结果发生例数随之增多。罗氏ElecsysHBsAgⅡquantⅡ和ElecsysHBsAgⅡ两套检测系统在一定条件下存在较好的线性关系，两者之间的倍数约为1/0.18。在ElecsysHBsAgⅡquantⅡ检测系统下，HBsAg待测标本经400倍稀释后的检测结果与原倍检测结果之间具有高度的一致性，判定系数R2=0.9938。结论：HBsAg多检测系统之间在一定条件下存在密切联系，且ELISA法检测HBsAg可以满足临床检测需求。

关键词：
乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒表面抗原
抗病毒疗法
效能评价
方法学
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过去三十年，高效疫苗和抗病毒疗法在预防和治疗乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）感染方面取得了重要进展，但HBV仍威胁人类健康，是肝硬化和肝癌的主要致病原因［1］。课题组在工作中发现，HBV表面抗原（hepatitisBvirussurfaceantigen，HBsAg）在临床实验室检测和临床医生解读检测结果中存在诸多问题，如实验室检测方法差异、检测灵敏度不高、检测结果不一致、不同检测系统不合适的性能评估，以及快速检测诊断检测误差等［2-9］。本研究以临床提到的报告解读问题，结合本实验室工作经验，探讨临床实验室检测HBsAg的方法学之间存在的关联及HBsAg实验室检测效能分析，以实现对HBsAg精准合理的检测，并为临床提供合理的检测结果解读。

1、资料与方法

1.1　资料　

1.1.1　样本来源　

收集南阳市中心医院2021年6月至2022年7月间，临床科室（感染肝病科为主）送检的筛查、疑似及确诊HBV感染患者标本共计100425例，查阅病例发现，患者均有HBV感染病史，相关数据包括乙肝五项定性/定量、HBsAg-定量、HBV-DNA（高灵敏）。本研究经南阳市中心医院医学伦理委员会审批。

1.1.2　主要试剂　

罗氏HBsAg［RocheElecsysHBsAgⅡ半定量法，单位：COI，批号：59364601；RocheElecsysHBsAgⅡquantⅡ定量法（400倍稀释），单位：U/ml，批号：59329401］；圣湘生物HBVDNA（高灵敏法，单位：copies/ml）检测试剂盒（批号：2022004）；上海科华HBsAg（ELISA法）检测试剂盒（批号：202206051）；厦门英科新创HBsAg（Immunecolloidalgoldtechnique，GICT，胶体金法）检测试剂盒；迈瑞HBsAg（CLIA）测定试剂盒（批号：211102）。阳性判断值、结果判读和检验结果的解释均严格按照试剂盒说明书进行，本实验室设定Cut/Off值为阴性对照A值均值+0.1，OD值为光密度值。

1.1.3　仪器　

ABI7500荧光定量PCR分析仪；圣湘生物NatchS全自动核酸提取仪；安图生物PHOMO酶标仪；罗氏Cobase601电化学发光全自动免疫分析系统；迈瑞CL-2000i化学发光全自动免疫分析系统。检测过程严格按照临床实验室标准操作规程（SOP）进行。

1.2　方法　

1.2.1　样本收集　

由专业护理人员进行无菌静脉穿刺真空管抽取空腹患者外周静脉血，采用消毒或无菌技术保持标本的完整性，分别置于EDTA-K2和促凝管内各2ml。标本采集后，3000g离心10min，上机检测。

1.2.2　检验方法　

包括分析前准备步骤和分析中实验操作步骤。严格按照对应检测试剂盒说明书进行定标、室内质控。HBsAg定量采用电化学发光法（定量/半定量）和化学发光法（chemiluminescenceimmunoassay，CLIA），HBsAg定性采用金标法，HBsAg半定量采用ELISA法，高灵敏HBV-DNA采用RT-PCR法进行检测。

1.3　统计学方法　

数据采集、统计描述及数据分析采用EXCEL2010版软件、GraphPadPrism6.01版软件和SPSS19.0版软件，率的比较采用Pearsonχ2检验。随机变量采用相关分析或线性回归，通过相关系数（r值）或判定系数（R2）和回归拟合方程（斜率）指标分析等效性，拟合曲线方程r≥0.99为线性良好。受试者工作特征（ROC）曲线界定Cut/Off，以ROC曲线下面积（AUC）≥0.9表示准确性和特异度较好。以P<0.05为差异有统计学意义。

图1　不同HBsAgS/CO区间值与其他检测方法学的相关性分析

2、结果

2.1ELISA法检测

HBsAg样本吸光度值与Cut/Off值的比值（S/CO值）与其他方法学的相关性分析　ELISA法检测HBsAg较低浓度（1<S/CO<5）（图1A）、低浓度（5≤S/CO<10）（图1B）和中浓度（10≤S/CO<30）（图1C）S/CO值与电化学发光法（半定量）有相关性，而高浓度（S/CO≥30）无相关性（图1D）；ELISA法检测HBsAgS/CO值与电化学发光法（定量）无相关性（图1E）；ELISA法检测HBsAgS/CO值与高灵敏HBV-DNA病毒载量无相关性（图1F）。

2.2HBsAg临床常用检测方法学差异分析　

样本来自临床确证HBV患者血清，以罗氏ElecsysHB‐sAgⅡ半定量法为依据，收集［0.8，2］COI标本13人份，（2，4］COI标本84人份，（4，100］COI标本49人份，>100COI标本29人份，分别进行定量（迈瑞）、ELISA法、金标法和RT-PCR法检测，各方法学差异性比较结果见表1。

2.3ELISA法和CLIA法检测HBsAgCut/Off值的设定　

筛选南阳市中心医院HBV患者血清HBsAgS/CO值在0.8~3的标本和HBsAg阴性S/CO值标本，总计1609例，进行电化学发光半定量检测，定量结果≥1.0COI为阳性，≥0.9COI、<1.0COI判定为临界，<0.9COI为HBsAg无反应性。结果显示，当采用ELISA法和CLIA法检测HBsAg时，Cut/Off值分别为0.105和0.070U/ml时，AUC最大，分别为0.986和0.988，见图2。

2.4ELISA法和CLIA法检测HBsAg检出限验证过程及结果　

对1U/ml定值HBsAg标准物质进行HBsAg阴性血清递减稀释，共计7份标本，连续5d分别进行ELISA法和CLIA法检测，结果判定HBsAg检出限分别为0.1U/ml和0.05U/ml，实验过程及结果（S/CO值≥1.0为阳性，Cut/Off>0.05U/ml为阳性）见表2。

2.5ELISA法检测HBsAg在常用报告模型和不同A值区间下假阳性和假阴性的分析　

分析100000例乙肝五项定性结果，以罗氏电化学发光半定量法和患者病史为参考依据，在乙肝五项常见报告模型中，单独HBsAg阳性的假阳性率最高（图3A-a）；HB‐sAg在不同OD值区间分布中，小于0.5区间（图3Ba）出现假阳性率最高（图3B）。在报告阴性的结果中，随着OD值由0.01到0.1逐渐增大，假阴性率的发生整体升高（图3C）。

表1HBsAg多种检测方法学间的差异分析

图2ELISA法和CLIA法检测HBsAg最佳临界值的设定

图3ELISA法检测HBsAg假阳性和假阴性的分布特征

表2HBsAg检出限的验证过程及结果（S/CO和U/ml）

2.6　罗氏ElecsysHBsAgⅡ和ElecsysHBsAgⅡquantⅡ之间的数学模型分析　

采用回归分析对同一份标本的HBsAg分别进行ElecsysHBsAgⅡquantⅡ原倍和1∶400倍稀释后检测，两者结果高度一致，判定系数R2=0.9938（图4A）。采用相关分析，对同一份标本的HBsAg分别进行ElecsysHBsAgⅡ、Elec‐sysHBsAgⅡquantⅡ原倍和1∶400倍稀释检测，除高浓度HBsAg检测在ElecsysHBsAgⅡquantⅡ1∶400倍稀释和ElecsysHBsAgⅡ之间不一致外（图4B），其他情况下均高度一致，R2分别为0.9947、0.9965（图4C、D）。在HBsAg低浓度和原倍检测情况下，罗氏ElecsysHBsAgⅡquantⅡ和ElecsysHBsAgⅡ之间存在倍数关系，即X/Y≈1/（0.1767或0.1791）≈1/0.18=5.5。

图4　罗氏HBsAg不同检测系统之间数学模型浅析

3、讨论

技术的进步带来医学HBsAg实验室检测新方法学层出不穷，包括金标法、ELISA法（定性/半定量）、板式化学发光法、管式化学发光法、磁微粒化学发光法、电化学发光法（定量/半定量），检测灵敏度越来越高［3，9］。但随着对隐匿性HBV患者和HB‐sAg血清清除免疫机制的深入研究，低水平HBsAg患者仍有病毒复制和持续肝损伤而容易被患者自身忽视，且我国慢性HBV发病率有上升趋势［10-14］。HBsAg作为血清学标志物预测抗病毒疗效，并在人群中大规模筛查所要求的灵敏度高，且中国孕妇HBV感染率为中度地方性流行的客观存在［15-17］，由此带来对实验室检测HBsAg更高的要求和临床医生对结果解读更大的困惑［2］，以上风险对实验室检测诊断和临床诊疗提出挑战。因此，本研究集合HBsAg常见临床实验室检测方法学，分析其内在联系，集合临床医生提出的对报告解读的困惑，分析医学实验室如何准确为临床答疑解惑，为临床解读、评估和预测患者HBsAg的真实情况提供依据［18］。

临床中经常遇到ELISA法检测乙肝五项定性结果与HBsAg定量和高灵敏HBV-DNA不一致，本研究发现，ELISA法检测低浓度和中浓度HBsAgS/CO值与电化学发光半定量法检测值之间有较好的相关性；较低浓度与电化学发光半定量法检测值之间有相关性；高浓度与电化学发光半定量法检测值之间无相关性；HBsAgS/CO值与病毒载量和电化学发光定量检测值之间无相关性。分析原因可能为：①ELISA法和电化学发光光半定量法两套HBsAg检测系统的线性范围在低浓度和中浓度之间存在重叠，在较低浓度时重叠一致性一般，在高浓度时无重叠；②高浓度HBsAg在两套检测系统检测时无法避免的钩状效应；③ELISA法检测HBsAg和RT-PCR检测病毒载量由于检测靶物质和检测方法学不同，检测结果相互独立，无可比性；④电化学发光定量法检测HBsAg与ELISA法S/CO值无相关性是由于定量检测时仪器自动对标本进行稀释400倍所致。

临床实验室在分析和报告实验结果时，无法规避假阴性和假阳性，本研究发现，在乙肝五项常见报告模型中，HBsAg假阳性的发生例数以单独HBsAg阳性报告模型出现的频次最多，因此实验室在签发报告时需留意，最好进行不同方法学检测结果的验证。对ELISA检测HBsAg结果A值小于0.5的区间需选用更高灵敏度的方法学进行验证，以减少或杜绝假阳性结果的出现。无论采用阴性对照法或ROC曲线法来界定HBsAg的Cut/Off值，均会造成假阴性结果的出现，但在OD值为0.04~0.1时的结果所发生的假阴性频次更高，该现象为实验室所重视。随着检测技术的迭代和上游原料工艺及流程的优化，HBsAg检测灵敏度和准确度大幅提高［19］。本研究发现，ELISA法检测HBsAg的检出限进一步提高至0.1U/ml，与罗氏的电化学发光法和迈瑞的化学发光法一致率和吻合程度较高，且国产试剂ELISA法和化学发光法的检测性能不亚于进口试剂，胶体金法对低浓度HBsAg亦显示出较好的敏感度和特异度，能很好地满足快速筛查需求［20］。当本实验室Cut/Off值设为0.105时，AUC最高达0.986，对于厂家给予的Cut/Off值参考公式，实验室可仅供参考，最好由自己的实验室通过ROC曲线来计算优化Cut/Off值，国产化学发光法的准确度和特异度同样如此，依此可有效降低假阳性和假阴性结果的发生率。由于罗氏ElecsysHBsAgⅡquantⅡ（单位U/ml，参考范围0~20）和ElecsysHBsAgⅡ（单位COI，参考范围0~1）两套检测HBs-Ag系统，由于单位和参考区间均不相同，对两者之间检测结果的差异问题，带给临床医生和实验室检测人员的困惑。本研究显示，罗氏ElecsysHBsAgⅡquantⅡ检测系统对HBsAg原倍检测结果与400倍稀释后的结果高度一致，显示出罗氏检测系统的高度稳定性。在HBsAg低浓度和原倍检测下，罗氏ElecsysHBsAgⅡquantⅡ和ElecsysHBsAgⅡ之间存在较为明显的倍数关系，即为5.5倍，两者之间可以进行换算。在HBsAg高浓度或稀释后检测下，两套系统无相关性，分析原因：①HBsAg高浓度检测下存在无法规避的钩状效应；②1∶400倍稀释带来的影响。

综上所述，本研究创新点在于：①从定性到定量，检验和分析HBsAg在临床实验室常用且复杂的不同检测系统，找到了不同检测系统之间特定的内在联系；②罗氏ElecsysHBsAgⅡquantⅡ和ElecsysHBsAgⅡ两套检测系统之间在特定情况下存在的数据换算公式；③本研究结果使得实验室检测过程中遇到的问题得以重视和解决，以及为临床检测结果提供合理解读。随着敏感度和特异度更高的HBsAg检测工艺和技术的出现，减少了假阳性和假阴性的发生率，使得临床实验室更好地服务于临床［21-22］，以实现对HBsAg的精准检测和诊疗。本研究不足之处在于，在集合目前检测HBsAg的方法学中，对每种方法学的性能评价不够全面，假阳性及假阴性结果在实验过程中产生的原因未进行深入探讨。针对上述研究不足及临床实验室检测乙型肝炎病毒生物学标志物新方法新技术的进展［23］，课题组将在后续研究中持续加以关注。

基金资助:国家自然科学基金(81871613);南阳市科技攻关项目(KJGG091);

文章来源:汪海霞,张舒林,赵莹莹,等.临床实验室检测乙型肝炎病毒表面抗原的方法学关联及效能分析[J].中国免疫学杂志,2025,41(07):1772-1776+1781.