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持续静压力通过TRPV4信号通路调控大鼠软骨细胞凋亡

2025-04-07 72 上传者：管理员

摘要：目的探讨持续静压力对大鼠软骨细胞凋亡的机制｡方法制备并培养原代大鼠软骨细胞,设置正常对照组､30 kPa压力组､GSK205对照组､GSK205+30 kPa压力组｡EdU荧光染色法检测软骨细胞在12､24､48 h的增殖率｡采用流式检测软骨细胞在24､48､72 h的凋亡率｡荧光标记测定软骨细胞内48 h时钙离子浓度｡免疫印迹法测定软骨细胞TRPV4､JNK､p-JNK､ERK1/2､p-ERK1/2､P38､p-P38蛋白24 h时相对表达水平｡结果与正常对照组比较,30 kPa压力组软骨细胞在各观察时间增殖率均显著减少(P<0.05);细胞凋亡率均显著增加(P<0.05);细胞内钙离子荧光强度增强;细胞内TRPV4､磷酸化的JNK､磷酸化的ERK1/2､磷酸化的P38均显著提高(P<0.05)｡与30 kPa压力组比较,给予TRPV4的阻断剂GSK205后,GSK205+30 kPa压力组的细胞增殖率显著上升;细胞凋亡率显著减少;细胞内钙离子荧光强度减弱;TRPV4､磷酸化的JNK､磷酸化的ERK1/2､磷酸化的P38均显著减少(P<0.05)｡结论 30 kPa持续静压力不仅抑制软骨细胞增殖,还增加软骨细胞凋亡,使细胞内钙离子浓度增加｡持续静压力促进大鼠软骨细胞凋亡的可能分子机制为通过TRPV4力学信号感受器激活MAPK信号通路｡

关键词：
MAPK信号通路
TRPV4蛋白
凋亡
持续静压力
软骨细胞
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骨代谢过程中,力学刺激可以影响细胞的功能和分化[1]｡软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞,通过感受及整合各种刺激信号,激活软骨组织的生成或降解,维持关节软骨功能[2]｡当软骨细胞受到异常力学刺激时,易诱发软骨细胞凋亡[3⁃4]｡瞬时受体电位香草素亚家族4 ( transient receptor potentialvanilloid 4,TRPV4)蛋白为软骨细胞内感知并传递力学刺激的感受器,是保护关节软骨的重要组成部分[5]｡研究发现30 KPa持续静压力可增加软骨细胞凋亡[6],本研究拟探讨30 KPa持续静压力对TRPV4蛋白及下游的丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases,MAPK)信号通路调控作用,试图阐明持续静压力通过TRPV4蛋白影响软骨细胞增殖凋亡的机制｡

1、材料与方法

1. 1动物与试剂

1. 1. 1实验大鼠:

6只体重约200 g的无特殊病原体雄性大鼠(品系为Wistar),由新疆医科大学动物实验中心提供｡

1. 1. 2主要试剂:

DMEM/ F12细胞基础培养液,白鲨生物科技公司;胶原酶,Worthington公司;胎牛血清,赛默飞世尔科技公司;胰蛋白酶( SH30042. 01)､青链双抗(SV30 010. 01),美国HyClone公司;GSK205 (5313690001),美国MCE公司;EdU荧光标记试剂盒(C0071 S)､钙离子荧光标记试剂盒(Fluo⁃3 AM),碧云天公司;Annexin V⁃FITC / PI细胞凋亡试剂盒(556547),美国BD公司;BCA蛋白定量试剂盒,美国Biosharp公司,TRPV4( ab307444)､p⁃ERK1 / 2 ( ab201015 )､ERK1 / 2 ( ab184699 )､p⁃P38(ab195049),英国Abcam公司､p⁃JNK ( 28891⁃1⁃AP )､JNK ( 22114⁃1⁃AP )､P38 ( 14064⁃1⁃AP ),Proteintech公司､β⁃actin(GB11001),武汉塞维尔公司,二抗(BL003A),白鲨生物科技公司｡

1. 1. 3仪器设备:

细胞压力加载仪( flexercell FX⁃5000C),美国Flex⁃cell公司;倒置荧光显微镜( IX71 ),德国Leica公司;全波长酶标仪(VARIOSKAN LUX),美国Thermo公司;细胞超净操作台( SW⁃CJ⁃1F),苏州安泰净化有限公司;CO2培养箱(Scientific 8000),美国Thermo公司;高速冷冻离心机(5500型),日本KUBOTA公司;流式细胞仪,美国BD公司;化学发光仪､电泳和转膜仪,美国BIORAD公司｡

1. 2实验方法

1. 2. 1大鼠软骨细胞制备:

Wistar大鼠安乐死,大鼠体表用75%的酒精浸润消毒,暴露颌关节,切取表层软骨组织,用含青霉素和链霉素的生理盐水洗涤3次,放入盛有不含胎牛血清DMEM/ F12培养基的无菌离心管中并剪碎,加入3 mL胰蛋白酶,37℃振荡消化25 min,离心并弃去上清,再加入质量浓度0. 3%的Ⅰ型胶原酶3 mL,继续消化3 h后,离心并弃去上清,用DMEM/ F12完全培养液重悬后置于培养瓶中,放置于培养箱中培养[7]｡后续实验为3~5代的软骨细胞｡

1. 2. 2细胞实验组别:

设置正常对照组､持续静压力组(30 KPa压力组)､TRPV4的阻断剂组(GSK205对照组)､TRPV4的阻断剂和持续静压力组(GSK205+30 KPa压力组)｡GSK205在培养液中的终浓度为5μmol / L[8]｡对30 KPa压力组和GSK205+30 KPa压力组的软骨细胞给予静水压力[9],将混合气体(空气 ∶CO2= 95∶5)充入压力罐,细胞瓶置于细胞压力加载仪中( flexercell FX⁃5000C),调整压力至30KPa,再放置于培养箱内,每2 d换液一次,用于后续实验｡对照组细胞常规培养｡

1. 2. 3 EdU荧光标记法测定软骨细胞增殖:

消化收集生长良好的细胞接种24孔细胞板,接种密度为3×104cells/孔,细胞贴壁后分组同1. 2. 2,不同处理持续至12､24､48 h时,参照EdU成像检测试剂盒,加入EdU孵育2 h后,经固定与促渗后,再进行Hoechst33342染细胞核,检测荧光强度,计算增殖比例｡

1. 2. 4流式检测软骨细胞凋亡:

消化收集生长良好的细胞接种6孔细胞板,接种密度为2 × 105cells/孔,细胞贴壁后分组同1. 2. 2,不同处理持续至24､48､72 h时,消化并收集细胞至流式小管内,按照标准步骤对细胞进行FITC和PI双重标记后,流式检测对应的荧光强度,分析计算细胞凋亡比例｡

1. 2. 5软骨细胞内钙离子检测:

消化收集生长良好的细胞接种24孔细胞板,接种密度为3×104cells/孔,细胞贴壁后分组同1. 2. 2,不同处理持续至48 h时,进行钙离子检测｡每孔加入Fluo⁃3 AM探针使其作用浓度为1 μmol / L,37℃ 避光染色孵育1 h,PBS洗涤2次,洗涤后37℃避光孵育30 min｡拍照观察并计算不同处理组的相对荧光强度｡

1. 2. 6免疫印迹实验:

消化收集生长良好的细胞接种6孔细胞板,接种密度为2×105cells/孔,细胞贴壁后分组同1. 2. 2,不同处理持续至24 h时,收集细胞后提取总蛋白并定量｡常规电泳,转膜至PVDF膜上,封闭2 h后,分别加入对应的一抗:TRPV4､p⁃JNK､JNK､p⁃ERK1 / 2､ERK1 / 2､p⁃P38､P38､内参β⁃actin,4℃冰箱过夜｡孵育二抗并洗涤后进行化学发光｡分析灰度值并进行归一化｡

1. 3数据处理

应用SPSS 18. 0软件对数据进行分析,数值用均数±标准差表示,以单因素方差分析进行组间的显著性差异比较,P<0. 05时认为差异具有统计学意义｡

2、结果

2. 1细胞形态

第3代软骨细胞形态见图1｡细胞贴壁生长,表面光滑,由于处于不同生长阶段大小不均一,但多数为中间凸起两端细长的梭形,少部分呈现椭圆形或多边形｡细胞分裂速度快,以1∶3传代时约3 d能够再次长满瓶壁｡与课题组前期制备的软骨细胞形态一致[7]｡

图1原代软骨细胞图

2. 2各组细胞增殖能力比较

在培养12､24､48 h时,与正常对照组相比,30KPa压力组细胞增殖率均显著降低( P < 0. 05),GSK205对照组细胞增殖差异均无统计学意义(P>0. 05);与30 KPa压力组比较,GSK205+30 KPa压力组细胞增殖均显著增加(P<0. 05)｡细胞增殖比例见表1,代表图见图2｡表明30 KPa流体静压力抑制了软骨细胞增殖速度,给予TRPV4的抑制剂GSK205后可逆转30 KPa流体静压力对软骨细胞增殖的抑制｡

表1各组细胞增殖比例

图2各组细胞EdU标记图

2. 3各组细胞凋亡情况比较

在培养24､48､72 h时,与正常对照组相比,30KPa压力组细胞凋亡均显著增加(P<0. 05),GSK205对照组细胞凋亡差异均无统计学意义(P>0. 05);与30 KPa压力组比较,GSK205+30 KPa压力组细胞凋亡均显著减少(P<0. 05)｡细胞凋亡比例见表2,代表图见图3｡表明30 KPa流体静压力加速了软骨细胞凋亡,给予TRPV4的抑制剂GSK205后可逆转30KPa流体静压力对软骨细胞的损伤｡

表2各组细胞凋亡比例

2. 4各组细胞内钙离子浓度比较

在培养48 h时,不同处理的4组钙离子荧光代表图见图4,测定的相对值分别为1. 00 ± 0. 18､4. 36±0. 50､0. 62±0. 02､1. 74±0. 11,各组间差异均具有统计学意义(P<0. 05)｡表明30 KPa流体静压力会导致胞内钙离子增多,给予GSK205后部分恢复钙离子的水平｡

图3各组细胞凋亡流式图

图4各组细胞钙离子染色图

2. 5各组细胞相关蛋白比较

与正常对照组相比, 30 KPa压力组细胞TRPV4､( p⁃JNK ) / ( JNK )､( p⁃ERK1 / 2 ) / ( ERK1 /2)､(p⁃P38) / (P38)均显著增加(P<0. 05),GSK205对照组细胞TRPV4､( p⁃JNK) / ( JNK)､( p⁃ERK1 /2) / (ERK1 / 2)､( p⁃P38) / ( P38)均显著降低( P <0. 05);与30 KPa压力组相比,GSK205+30 KPa压力组细胞TRPV4､( p⁃JNK) / ( JNK)､( p⁃ERK1 / 2) /(ERK1 / 2)､(p⁃P38) / (P38)均显著降低(P<0. 05)｡蛋白条带见图5,蛋白灰度值比见表3｡表明30KPa流体静压力提高了软骨细胞内TRPV4､磷酸化的JNK､磷酸化的ERK1 / 2､磷酸化的P38表达,给予TRPV4的抑制剂GSK205后可阻止30 KPa流体静压力导致的TRPV4､磷酸化的JNK､磷酸化的ERK1 / 2､磷酸化的P38高表达｡

图5各组相关蛋白条带

表3 30 kPa压力对软骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响

3、讨论

静压力能够模拟生理状态下关节软骨表面受到的压力和变形,修饰细胞形态,是研究软骨细胞承载高强度关节载荷的主要方式[10]｡体外研究表明,间歇静水压促进软骨细胞系ATDC5向软骨方向分化成熟,软骨特征基质分泌增加[11]｡但过载的力学负荷可诱发胶原降解､糖胺聚糖丢失以及软骨细胞凋亡,成为骨关节炎的主要发病因素之一[12]｡前期结果初步表明,30 KPa持续流体压力会抑制软骨细胞增殖,使髁突软骨正常发育受到抑制[6,13]｡本研究结果也显示采用30 KPa静水压作用于颌关节软骨细胞持续24 h后,细胞增殖减少,凋亡增加｡软骨细胞的数量和活力决定了软骨基质的形成速度｡本研究进一步测定了软骨细胞内钙离子浓度,结果显示30 KPa压力作用48 h后软骨细胞内钙离子浓度显著升高｡软骨细胞受到异常应力刺激后钙通道开放,胞内游离钙离子浓度增加,线粒体会摄取细胞内过多的钙离子,从而导致线粒体内的钙超载[14],这可能是异常压力抑制软骨细胞增殖,并促进凋亡的作用途径｡TRPV4属于瞬时感受器电位离子通道( TRP)家族,是钙离子通透的非选择性的阳离子通道,广泛分布在多种生物体组织和细胞中,其可被多种机械力信号所激活[15⁃16]｡TRPV4在生理载荷下力的转导,可促进软骨细胞的生长及保护其功能,但在超过一定强度后会使软骨细胞凋亡,诱发骨关节炎等疾病[17]｡本研究结果显示,30 KPa静压力可显著上调颌关节软骨细胞TRPV4的表达,而加入TRPV4的抑制剂GSK205后,再给予30 KPa静压力软骨细胞的TRPV4表达显著下调,细胞内钙离子水平也显著下降,这可能是异常压力使软骨细胞线粒体钙超载的分子机制｡加入GSK205后,再给予30 KPa静压力,可显著缓解软骨细胞的增殖抑制和凋亡增加,减少异常压力对软骨细胞的损伤｡力学刺激可以通过多种信号通路调控软骨细胞的活力及功能,进而影响软骨的生理功能｡柳根哲等[18]研究显示持续加载1. 0 MPa静水压24 h,可促进p38蛋白的磷酸化,加速终板软骨细胞凋亡｡Wnt / β⁃catenin途径也参与调节软骨细胞活力,1 ~ 5MPa静水压作用3 h可以增加B淋巴细胞瘤⁃2基因的表达,促进软骨细胞凋亡[19]｡MAPK信号通路包括JNK､ERK和p38等3种途径,通过调节软骨细胞生长和功能,减轻关节炎症､阻止细胞外基质降解[20]｡本研究系统考察了30 KPa静压力对软骨细胞MAPK信号通路的调控作用,发现30 KPa静压力激活了MAPK信号通路,使JNK､ERK1 / 2和P38的磷酸化增多,给予TRPV4抑制剂GSK205后部分逆转该现象｡这可能是静压力导致软骨细胞的损伤的分子机制｡本研究为体外实验,后续将在体内进一步考察过大的载荷对TRPV4⁃MAPK信号通路的调控机制｡综上所述,30 KPa静压力持续作用,可导致软骨细胞内钙超载,进而抑制软骨细胞增殖,并促进凋亡｡持续静压力促进大鼠软骨细胞凋亡可能的作用机制为通过TRPV4激活MAPK信号通路｡

参考文献:

[1]邓海艳,孙江伟,古丽再努·依不拉音,等.牵张应力调控Notch1信号通路促进大鼠BMSCs增殖和成骨分化[J].中国骨质疏松杂志, 2023, 29(6): 802⁃806, 824.

[3]何东,李艳华,姚红英.异常机械负荷加重大鼠颞下颌关节骨关节炎的组织病理学研究[J].重庆医科大学学报, 2023,48(6): 641⁃646.

文章来源:梁秋娟,刘潇,古丽奴儿·沙吾提,等.持续静压力通过TRPV4信号通路调控大鼠软骨细胞凋亡[J].中国骨质疏松杂志,2025,31(04):507-511+517.