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芒柄花素对脓毒症大鼠急性肺损伤和免疫功能的影响及其机制

2024-06-24 46 上传者：管理员

摘要：目的探讨芒柄花素(Formo)调节高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/晚期糖基化终产物受体(RAGE)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路对脓毒症大鼠急性肺损伤和免疫功能的影响。方法通过盲肠结扎和穿刺方法建立脓毒症大鼠，将造模后的大鼠随机分为脓毒症组、低剂量Formo(Formo-L)组(15 mg/kg Formo)、Formo中剂量(Formo-M)组(30 mg/kg Formo)、Formo高剂量(Formo-H)组(60 mg/kg Formo)、Formo-H+重组HMGB1蛋白(r HMGB1)组(60 mg/kg Formo+8μg/kg r HMGB1)，并以仅做切口，不进行盲肠结扎或穿刺的大鼠为假手术组。干预结束后，检测大鼠肺组织湿干比(W/D)；腹部取血，流式细胞术及ELISA分别检测大鼠免疫功能及白细胞介素-6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平；苏木精-伊红(HE)染色检测右肺上叶病理学变化；Western blot检测肺组织中HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路相关的蛋白表达。结果与对照组相比，脓毒症组肺组织病理损伤严重，CD4+、CD4+/CD8+显著降低，TNF-α,IL-1β,IL-6水平、病理损伤评分、W/D、CD8+、HMGB1、RAGE、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达比较显著增加(P<0.05)；与脓毒症组相比，Formo-L组、Formo-M组、Formo-H组病理损伤得到改善，CD4+、CD4+/CD8+显著增加，TNF-α,IL-1β,IL-6水平、病理损伤评分、W/D、CD8+、HMGB1、RAGE、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达显著降低，组间有差异(P<0.05)；与Formo-H组相比，Formo-H+r HMGB1组病理损伤加重，CD4+、CD4+/CD8+显著降低，TNF-α,IL-1β,IL-6水平、病理损伤评分、W/D、CD8+、HMGB1、RAGE、p-NF-κB p65/NF-κB p65表达显著增加(P<0.05)。结论 Formo可能通过抑制HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路减轻脓毒症大鼠急性肺损伤，提高免疫功能。

关键词：
免疫功能
急性肺损伤
脓毒症
芒柄花素
高迁移率族蛋白B1/晚期糖基化终产物受体/核转录因子-κB信号通路
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急性肺损伤是一种以呼吸衰竭、肺水肿、肺泡⁃毛细血管膜屏障、免疫/炎症反应为特征的疾病，急性肺损伤由于缺乏有效的治疗选择，极易发展为严重形式的急性呼吸窘迫综合征，可危及患者生命，全球死亡率较高[1]。急性肺损伤发病机制中，脓毒症是导致其发生的主要危险因素，但其确切机制仍然模糊不清，有效药物也极为有限，因此探索脓毒症诱发的急性肺损伤的发病机制以寻找有效的干预措施改善脓毒症[2,3]。芒柄花素（For⁃mo）从中药黄芪中提取的一种生物活性异黄酮，在多种疾病中具有显著的抗炎和抗氧化作用，包括多种肺部疾病，如哮喘[4]。高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1,HMGB1）/晚期糖基化终产物受体（Receptor for dvanced glycation endproducts,RAGE）/核转录因子⁃κB(Nuclearfac⁃tor kappa⁃B,NF⁃κB）通路是与炎性相关的通路，可刺激炎症介质及细胞因子，导致组织损伤，参与多种炎症性疾病的发生[5]。Zhou等[6]研究发现在脂多糖诱导的急性肺损伤中，激活HMGB1/RAGE信号诱导肺泡上皮细胞损伤和炎症。但Formo能否改善脓毒症大鼠急性肺损伤及免疫功能鲜有报道。本研究旨在探讨Formo对脓毒症大鼠急性肺损伤和免疫功能的影响及相关机制的探索。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

将6周龄，体质量200～230g雄性SD大鼠（济南朋悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20220006）饲养在12 h明暗循环，温度为22°C～25°C，湿度为50%～55%的受控环境中。大鼠随意获得食物和水，本研究的所有实验均经中国人民解放军联勤保障部队第901医院动物护理和使用委员会批准（审批号20220103），并按照《实验动物护理和使用指南》进行。

1.1.2主要试剂与仪器

Formo（美国MCE）、重组HMGB1蛋白⁃rHMGB1(Sigma),IL⁃6、IL⁃1β、TNF⁃α酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（酶联科技），RIPA裂解物（碧云天）、BCA蛋白质定量试剂盒（北京定国长生），HMGB1、RAGE、NF⁃κBp65、p⁃NF⁃κBp65一抗（Abcam);iMark680多功能酶标仪（美国Bio⁃Rad）、FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton⁃Dickinson）、BX51光学显微镜（日本Olym⁃pus），等。

1.2方法

1.2.1脓毒症大鼠模型的制备及干预

大鼠适应性喂养1周后，采用盲肠结扎和穿刺方法建立脓毒症大鼠[7]:50 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠并以仰卧位固定在手术台上，大鼠腹部做一个2 cm的纵向中线切口，露出盲肠，粪便被推到盲肠一侧，然后在距盲肠末端约1cm处结扎暴露的盲肠，用7号针刺穿盲肠远端（穿过盲肠），轻轻挤压盲肠挤出少量粪便后，然后将盲肠轻轻放回腹腔，缝合腹部肌肉组织和皮肤，消毒。随机选取12只大鼠除了盲肠结扎或穿刺外，均进行上述相同的操作，记为假手术组。术后观察大鼠一般状况，并从造模大鼠及假手术组大鼠随机选取2只进行肺组织病理学观察，当大鼠出现动作缓慢、呼吸急促以及高热等症状，肺组织病理学显示肺泡结构破坏、炎症细胞浸润及肺泡水肿增厚，标志着脓毒症大鼠造模成功[8]。将造模成功的大鼠随机分为脓毒症组、低剂量Formo(Formo⁃L）组、中剂量Formo(For⁃mo⁃M）组、高剂量Formo(Formo⁃H）组、Formo⁃H+rHMGB1组。其中Formo⁃L组、Formo⁃M组、Formo⁃H组分别腹腔注射15、30、60 mg/kg Formo，尾部注射生理盐水干预[9];Formo⁃H+rHMGB1组腹腔注射60 mg/kg Formo，尾部注射8μg/kg rHMGB1干预[10]；脓毒症组和假手术组腹腔注射及尾部注射等体积生理盐水干预。

1.2.2大鼠肺组织湿干比（W/D)

干预24 h后，麻醉大鼠，分离大鼠左肺上叶，取出后立即称重肺切片（湿重，W）；随后使用60°C烘箱干燥48 h并重新称重（干重），计算大鼠肺组织湿干比（W/D）。

1.2.3流式细胞术检测大鼠免疫功能

麻醉大鼠，腹部取血置于15 mL离心管（含1 mL抗凝剂）中，离心后，加入磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，保留沉淀，加入PBS重悬细胞，采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，PBS洗涤并重悬后，取100μL细胞悬液加入含10μL T细胞表面标志物FITC⁃CD3、PE⁃CD4、APC⁃CD8单抗的离心管中，4℃下避光孵育10min，流式细胞分析仪检测T细胞亚群，分析CD4+、CD8+细胞百分率，计算CD4+/CD8+比例。

1.2.4 ELISA检测各组血清中TNF⁃α,IL⁃1β,IL⁃6水平

按照试剂盒要求检测血清中TNF⁃α、IL⁃1β和IL⁃6水平。

1.2.5 HE检测右肺上叶病理学变化

分离右肺上叶并用4%多聚甲醛固定，然后用不同浓度的乙醇溶液（70%～100%）脱水，石蜡包埋后，制备4μm切片，并依次在二甲苯，无水乙醇中脱蜡，最后组织样本进行苏木精⁃伊红（HE）染色，5 min后用水冲洗，伊红复染，并对组织切片进行浸润程度、肺泡和间质性水肿、肺组织出血程度进行病理学评分：0分为正常肺组织；1分为轻度肺损伤（小于25%损伤）；2分为中度肺损伤（25%～50%损伤）；3分为重度肺损伤（50%～75%损伤）；4分为极度肺损伤（75%以上损伤）。

1.2.6 Westernblot检测HMGB1、RAGE、NF⁃κB p65、p⁃NF⁃κB p65蛋白表达

用放射免疫沉淀测定法（RIPA）裂解物裂解右肺上叶组织蛋白，超声离心后收集上清液，使用BCA测定蛋白质浓度，将等量的蛋白质与上样缓冲液混合，并在95°C下加热10min，经SDS⁃PAGE分离并转移到膜上，密封2 h后与相应的一抗（HMGB1、RAGE、NF⁃κB p65、p⁃NF⁃κB p65）孵育过夜。次日，洗膜3次，以HRP标记的抗兔或抗鼠作孵育1.5 h，并通过化学发光成像系统观察蛋白质条带并用Image J软件定量，内部参比蛋白为GAPDH。

1.3统计学分析

实验数据采用SPSS26.0软件分析，计量数据以均值±标准差（Mean±SD）表示，多组间比较以单因素方差分析，SNK⁃q检验进一步两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Formo对脓毒症大鼠左肺上叶W/D的影响

左肺上叶W/D比较：脓毒症组较假手术组显著增加（P<0.05);Formo⁃L组、Formo⁃M组、Formo⁃H组较脓毒症组显著降低，组间差异有统计学意义（P<0.05);Formo⁃H+rHMGB1组较Formo⁃H组显著增加（P<0.05）（表1）。

表1各组大鼠左肺上叶W/D的比较（Mean±SD)

2.2 Formo对脓毒症大鼠免疫功能影响

与对照组相比，脓毒症组CD4+、CD4+/CD8+显著降低，CD8+显著增加（P<0.05）；与脓毒症组相比，Formo⁃L组、Formo⁃M组、Formo⁃H组CD4+、CD4+/CD8+显著增加，CD8+显著降低，组间差异有统计学意义（P<0.05）；与Formo⁃H组相比，Formo⁃H+rHMGB1组CD4+、CD4+/CD8+显著降低，CD8+显著增加（P<0.05）（表2）。

2.3 Formo对脓毒症大鼠肺组织病理学的影响

假手术组无显著病理变化；脓毒症组大鼠肺组织出现肺泡壁增厚、炎性细胞浸润等明显病理特征，病理评分较假手术组显著增加（P<0.05）；经Formo⁃L、Formo⁃M、Formo⁃H干预后，上述病理特征得到明显改善，病理评分较脓毒症组显著降低，组间差异有统计学意义（P<0.05);Formo⁃H+rHMGB1组病理特征较Formo⁃H加重，病理评分显著增加（P<0.05）（图1，表3）。

表2各组大鼠CD4+、CD4+/CD8+、CD8+的比较（Mean±SD)

2.4 Formo对脓毒症大鼠血清TNF⁃α,IL⁃1β,IL⁃6水平的影响

TNF⁃α,IL⁃1β,IL⁃6水平比较：脓毒症组较假手术组显著增加（P<0.05);Formo⁃L组、Formo⁃M组、Formo⁃H组较脓毒症组显著降低，组间差异有统计学意义（P<0.05);Formo⁃H+rHMGB1组较For⁃mo⁃H组显著增加（P<0.05）（表4）。

2.5 Formo对脓毒症大鼠肺组织中HMGB1、RAGE、NF⁃κB p65、p⁃NF⁃κB p65表达影响

HMGB1、RAGE、p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65表达比较：脓毒症组较假手术组显著增加（P<0.05);For⁃mo⁃L组、Formo⁃M组、Formo⁃H组较脓毒症组显著降低，组间差异有统计学意义（P<0.05);Formo⁃H+rH⁃MGB1组较Formo⁃H组显著增加（P<0.05）（图2）。

图1各组大鼠肺组织病理学变化（HE染色，×400)

表3各组大鼠肺组织评分的比较（Mean±SD)

3、讨论

脓毒症是由宿主对入侵病原微生物引起的急性多器官功能障碍，而肺是最脆弱的靶器官，急性肺损伤可进展为急性呼吸窘迫综合征，最终导致多器官功能障碍和死亡[11]。作为脓毒症应用最广泛、最具代表性的动物模型，盲肠结扎和穿刺是脓毒症模型研究的金标准[12]。本研究通过盲肠结扎和穿刺建立脓毒症大鼠，当大鼠出现动作缓慢、呼吸急促以及高热等症状，肺泡水肿增厚、肺泡结构破坏、炎症细胞浸润等病理损伤，标志着大鼠造模成功，可用于更进一步的研究。

表4各组大鼠血清TNF⁃α,IL⁃1β,IL⁃6水平比较（pg/mL,Mean±SD)

Formo是异黄酮的主要成分，具有多种药理作用，其抗炎特性已有报道。如芒柄花素通过抑制炎症反应保护皮层神经元[13]。此外，Formo在多种肺部疾病均有研究，在高氧诱导的急性肺损伤模型，Formo预处理显著减弱肺含量及抑制促炎细胞因子水平以及肺中性粒细胞浸润，保护高氧诱导的急性肺损伤[14]。在野百合碱诱导的肺动脉高压研究中，Formo可以通过抑制肺血管重塑减轻肺动脉高压[15]。但在脓毒症诱导的急性肺损伤中，Formo鲜有报道，本研究发现脓毒症大鼠肺组织病理损伤严重，W/D及血清中TNF⁃α,IL⁃1β,IL⁃6水平显著增加，提示脓毒症诱导了急性肺损伤的进展，其中炎症反应在其中发挥重要作用[16]。但经不同剂量的Formo干预后，炎性反应降低，急性肺损伤得到缓解。T淋巴细胞的数量的在一定程度上反应免疫功能状态，而脓毒症组大鼠CD4+、CD4+/CD8+显著降低，CD8+显著升高，提示脓毒症大鼠免疫功能遭到破坏，而Formo干预可提高大鼠免疫功能，抑制炎性反应，改善急性肺损伤，但其机制有待探究。

图2各组大鼠肺组织中HMGB1、RAGE、NF⁃κB p65、p⁃NF⁃κB p65蛋白表达

HMGB1/RAGE/NF⁃κB通路与许多疾病的炎症密切相关[17⁃18]。HMGB1的致病作用依赖于HMGB1与其受体RAGE的相互作用以及下游NF⁃κB通路的激活，因此，抑制HMGB1介导的炎症途径成为治疗疾病的关键[19]。已有研究表明右美托咪定抑制HMGB1/RAGE/NF⁃κB通路可实现对盲肠结扎穿孔造成的急性肺损伤小鼠的保护[20]。本研究发现脓毒症大鼠肺组织中HMGB1、RAGE、p⁃NF⁃κB p65/NF⁃κB p65表达明显上调，提示脓毒症诱导急性肺损伤可能与激活HMGB1/RAGE/NF⁃κB通路有关。Formo干预后，肺组织中HMGB1、RAGE、p⁃NF⁃κBp65/NF⁃κBp65表达被抑制，炎性反应降低，大鼠免疫功能增强，肺组织损伤得到改善，推测Formo可能通过抑制HMGB1/RAGE/NF⁃κB通路改善脓毒症诱导急性肺损伤，提高免疫功能。为进一步验证实验结论，实验以rHMGB1进行回复验证，结果发现rHMGB1逆转了Formo⁃H对脓毒症诱导急性肺损伤的保护作用。由此可知，Formo⁃H对脓毒症诱导急性肺损伤的保护作用是通过抑制HMGB1/RAGE/NF⁃κB通路实现。

综上所述，Formo通过抑制HMGB1/RAGE/NF⁃κB通路降低炎性因子水平，改善肺组织损伤，提高大鼠免疫功能，但对于临床研究以及后续长期的效果如何，仍需后续研究。

作者贡献声明李慧负责科研设计、数据分析整理以及文章撰写、修改；李璐璐负责实验指导及文章审阅

利益冲突声明所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中均不存在利益冲突

机构伦理问题研究方案经中国人民解放军联勤保障部队第901医院动物伦理委员会批准

参考文献:

[5]尚立芝,李耀洋,季书,等.二陈汤加味通过HMGB1/RAGE/NF-κB信号通路对COPD大鼠细支气管炎症的影响[J].中国实验方剂学杂志,2023, 29(6):44-54.

[7]段金旗,林艳.姜黄素对脓毒症急性肺损伤大鼠的保护作用[J].中国免疫学杂志,2020, 36(19):2380-2383.

[9]周海银,罗兰,陈艳瑛,等.刺芒柄花素通过调控SIRT1/PGC-1α通路对脓毒症诱导的大鼠急性肾损伤的影响[J].中医药导报,2022, 28(1):6-11.

[11]曾龙,胡洪波.替加环素治疗小鼠脓毒症肺损伤的作用及其对Wnt5a与Syndecan-1的影响[J].解剖学研究,2021, 43(5):497-502.

[17]徐晓义,潘艳,黄小俊,等.姜黄素抑制肺上皮细胞BEAS-2B真菌产生炎症细胞因子的作用[J].解剖学研究,2020, 42(3):225-227.

文章来源:李慧,李璐璐.芒柄花素对脓毒症大鼠急性肺损伤和免疫功能的影响及其机制[J].解剖学研究,2024,46(03):236-241.