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经皮小脑延髓池穿刺重复抽取大鼠脑脊液的方法研究

2025-03-25 119 上传者：管理员

摘要：目的：提出一种操作简便、重复性高的方法，可用于重复采集大鼠脑脊液（cerebrospinal fluid,CSF）样本。方法：25只SD大鼠随机分为对照组和实验组。实验组大鼠麻醉后，调整其头部相对于身体呈45°～90°，以枕骨隆突和第一颈椎之间的中心位置为进针点，针尖向头侧，平行于大鼠头部弯曲方向缓慢刺入，进针深度约为5 mm。缓慢抽吸CSF并记录采样量。通过观察大鼠体重变化和Bederson评分，伊文思蓝和HE染色，检测CSF白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)进行综合评估。结果：实验组大鼠首次采样成功14只（70.0%），采样量为（93.30±13.33）μL。连续二次采样成功10只（50.0%），第二次采样量为（93.00±19.86）μL。连续三次采样成功8只（40.0%），第三次采样量为（89.75±7.72）μL。连续三次采样成功组的大鼠体重增加（47.6±1.51）g，与对照组相比差异无统计学意义（P>0.05）。实验组大鼠Bederson评分均为0分，提示未造成明显神经功能缺损。未观察到明显的伊文思蓝染色和脑组织形态学改变。三次采集的CSF样本中IL-6含量分别为（28.98±4.70）pg/mL、（29.37±6.06）pg/mL和（30.06±5.47）pg/mL，三次对比差异无统计学意义（P>0.05）。第一次采样失败后再次采样成功的CSF样本IL-6含量升高（P<0.05）。结论：经皮小脑延髓池穿刺抽取CSF的方法所需器材简单，操作时间短，可单人操作，且对动物创伤小。

关键词：
小脑延髓池
方法研究
经皮穿刺
脉络膜
脑脊液
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脑脊液（cerebrospinal fluid，CSF）是由脑室中脉络膜产生的一种无色澄清的液体，循环于各个脑室、蛛网膜下腔、脑池和脊髓中央管中，最终通过蛛网膜粒的微血管进入静脉系统[1,2]。CSF包括葡萄糖、蛋白质、胆固醇、细胞因子、生长因子和营养素等物质[3,4]，其与血液由血脑屏障隔开，在脑内形成较为独立的体液系统。这些特征使其成为支持中枢神经系统的重要生理流体。CSF成分和性状的改变，可以反映中枢神经系统的病变情况和脑组织代谢功能异常。因此，CSF被广泛应用于生物化学、药理学、神经解剖学等研究领域中[5]。CSF分析对许多疾病的诊断至关重要，因为某些物质，如抗体、特殊蛋白质或疾病特有的病原体只能在CSF中找到。CSF可作为诊断中枢神经系统疾病的常用检测样本，包括感染性疾病[6]、自身免疫性疾病[7]、脑出血[8]、脑积水[9]和阿尔茨海默病[10,11]。CSF为发现中枢神经系统的病理生理状态提供了重要的窗口和样本来源[12,13]。此外，对于脑部疾病的干预而言，尽管许多药物有中枢神经活性，但由于血脑屏障阻碍了这些物质进入病变部位而无法发挥作用。由于CSF中含有透过血脑屏障的成分[2]，因此CSF药理学的结果比血清药理学更可信。大鼠CSF采样点通常选择侧脑室、小脑延髓池、蛛网膜下腔以及腰大池。常用的提取CSF的方法包括侧脑室穿刺[14]、小脑延髓池插管[15]、直视下小脑延髓池穿刺[16]、腰椎穿刺[17]、经皮穿刺[18]等。大鼠脑室及蛛网膜下腔内血管丰富，空间狭小，使得抽取CSF的难度较大，且容易损伤延髓而导致大鼠死亡[19,20]。侧脑室采样需打开颅骨，且借助脑定位仪进行精密定位。腰椎穿刺从腰大池采样，其操作繁琐、耗时、损伤大，可收集的CSF量少，穿刺成功率低。由于小脑延髓池定位相对简便，故实验中常选取该处。直视下经小脑延髓池抽取CSF多采用脑立体定位仪辅助进行，需两人配合，操作相对复杂、用时长[21,22]，需分离颈部肌肉，为一次性有创操作[23]。Nirogi等[18]提出的经皮穿刺方法重复使用改造的注射器，有样本交叉污染的风险，且需要脑定位仪辅助。针对以上问题，本文介绍了一种经皮小脑延髓池穿刺抽取大鼠CSF的方法。该技术具有所需器材简单，操作时间短，可单人操作，且对动物创伤小等优点。此外，此方法可间断重复抽取CSF进行分析，为利用大鼠CSF进行相关研究提供了简单易行的实验技术支持。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

25只8周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量（260±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司（SYXK（京）2023-0011）提供，饲养于25°C恒温，相对湿度50%，常规饲料与自由饮水，以及12 h光照/黑暗交替循环的屏障环境中。按随机数字表法随机分为对照组（5只）和实验组（20只）。对照组大鼠不进行干预操作，实验组大鼠操作前适应性饲养3 d。本实验规程及方案符合北京中医药大学动物伦理审查标准（伦理审查编号：BUCM-2024031502-1201）。

1.1.2实验试剂和设备

伊文思蓝染色液0.5%（G1810）和4%组织固定液（P1110）购自北京索莱宝科技有限公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0010）购自碧云天生物技术公司，白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（KE10007）购自美国Proteintech公司，Springe一次性无菌胰岛素注射器（29G）购自美国Becton公司，异氟烷购自瑞沃德公司。R500小动物通用型麻醉机购于瑞沃德公司，SorvallLegend Micro 21R微量离心机、Varioskan Lux多功能酶标仪购于美国赛默飞公司，RM2245组织切片机购于德国莱卡公司，自动组织HE染色机购于上海Epredia公司，一体化荧光显微成像系统购于基恩士公司。

1.2方法

1.2.1经皮小脑延髓池穿刺方法

大鼠在3.0%异氟烷诱导麻醉后，予1.5%异氟烷维持麻醉。75%酒精消毒大鼠颈部和枕部，使大鼠头部向前弯曲，相对于身体成45°～90°，左手拇指和中指固定于双侧耳部，食指定位枕骨大孔，枕骨隆突和第一颈椎之间的卵圆形软组织区域的中心位置，即为穿刺部位，见图1A、图1B。右手持一次性无菌胰岛素注射器，见图1C，针尖向头侧，平行于大鼠头部弯曲方向，缓慢刺入皮下，进针深度约为5 mm，进针手势和部位见图1D。经过寰枕膜时可能会有些许阻力，待有针下有落空感后立即停止进针，缓慢抽吸，可见澄清无色的CSF，提示CSF抽取成功，见图1E。CSF抽取完毕后拔针，局部酒精消毒。若抽吸出血性CSF，则为失败，见图1F。采样量控制在100μL左右，将CSF移入1.5 mL离心管中，离心后吸取上清放入－80℃冰箱中保存。穿刺后观察2 d，抽取成功的大鼠进行下一次采样。最后一次采样24 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，心脏灌注后取脑组织，实验流程见图1I。

1.2.2大鼠生长发育和神经功能的评估

大鼠生长发育通过测量大鼠的体重评估。分别于第1天和取材当天测量大鼠的体重，记录体重的变化情况。根据Bederson神经功能缺损评分标准（0～3分）[24]评估大鼠神经功能，穿刺完24 h后对大鼠进行神经功能学评分并记录。正常情况下，轻抓鼠尾使鼠身高于桌面10 cm，大鼠前爪会向前伸直。分数越高，表明神经功能损伤越严重。

1.2.3伊文思蓝染色测定血脑屏障通透性

大鼠于取材前1 h尾静脉注射0.5%的伊文思蓝染色液（3 mL/kg），1 h后心脏生理盐水灌注取脑，拍照记录并直视评估大鼠脑组织的伊文思蓝染色情况。分别取大脑皮质和小脑组织，通过酶标仪测定波长620 nm处的吸光度（OD）。称取25 mg脑组织置于1.5 mL离心管中，加入1 mL预冷的PBS，用组织匀浆器研磨，4℃10 000/rpm离心20 min后取上清用于检测。同时测定浓度梯度的伊文思蓝溶液的OD值，绘制标准曲线。使用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质含量。根据标准曲线计算出待测样品的伊文思蓝含量（μg/g）。伊文思蓝含量越高，表明血脑屏障的损伤程度越大[25]。

1.2.4 HE染色观察组织形态学

所取脑组织在4%组织固定液中充分固定48 h以上，脱水透明后进行石蜡包埋并切成厚5μm的冠状切片，放入HE全自动染色机进行染色。显微镜下观察脑组织形态学并拍摄。

1.2.5 ELISA法检测CSF IL-6的含量

使用ELISA试剂盒，按照说明书步骤测定各组CSF中IL-6的含量。

1.3统计学处理

应用SPSS 25.0和Rstudio软件进行数据分析和绘图。正态分布的计量数据以（x±s）表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料以率（%）表示，χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 CSF抽取情况实验组

20只大鼠，第一次采样成功14只（70.0%），失败4只，大鼠死亡2只。第一次采样量为（93.30±13.33）μL。连续两次采样成功10只（50.0%），第二次采样量为（93.00±19.86）μL。连续三次采样成功8只（40%），第三次采样量为（89.75±7.72）μL。三次采样量差异无统计学意义（P＞0.05），见图2A，提示连续采样的采样量具有一致性。选取部分第一次采样失败的大鼠进行第二次采样，可见第二次采样成功的样本颜色已较为清亮透明，从外观未观察到显著异常。

2.2大鼠生长发育和神经功能的比较

适应性饲养前，对照组大鼠体重为（257.8±2.3）g，实验组为（252.3±3.5）g。在取材前，实验组中连续三次抽取CSF的大鼠体重为（300.1±2.8）g，体重增加（47.6±1.51）g，与对照组相比[体重（304.8±2.8）g，体重增加（47.8±1.48）g]，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2B。大鼠麻醉苏醒后检查神经功能，实验组除2只死亡以外，其余大鼠Bederson评分均为0分。以上结果提示经皮小脑延髓池穿刺对大鼠生长发育和神经功能无显著影响。

2.3大鼠血脑屏障通透性结果

伊文思蓝注射后，对照组和实验组的脑组织均未观察到明显的染色改变，见图2E～G、图2J～L。实验组中连续三次采样成功大鼠大脑和小脑组织的伊文思蓝含量分别为（1.00±0.14）μg/g和（0.99±0.10）μg/g，与对照组相比[大脑（0.93±0.17）μg/g，小脑（1.01±0.18）μg/g]，差异无统计学意义（P＞0.05），见图2C。

2.4 IL-6表达水平的比较

三次采样成功所取CSF的IL-6含量分别为（28.98±4.70）pg/mL、（29.37±6.06）pg/mL和（30.06±5.47）pg/mL，三次相对比差异无统计学意义（P＞0.05），见图2D。第一次采样失败后再次采样成功的CSF样本IL-6含量为（49.73±8.72）pg/mL，与第一次采样成功的样本相比升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示尽管CSF外观已无显著异常，但造成的神经炎症损伤短期内难以恢复。

图1 CSF采集和实验流程

图2 CSF采集情况和穿刺对大鼠的影响

2.5组织形态学结果

HE染色结果显示，与对照组相比，实验组三次采样成功大鼠的大脑皮质和小脑组织未见明显的水肿、坏死和胶质细胞增生，见图2H、图2I和图2M、图2N，表明该穿刺方法对大鼠脑组织无明显损伤。

3、讨论

本研究建立了一种经皮小脑延髓池穿刺多次抽取大鼠CSF的方法。实验结果表明成功的穿刺短期内对大鼠生长发育和神经功能无显著影响，CSF炎症因子IL-6、血脑屏障功能和脑组织形态学无明显改变。该方法简便易行，对大鼠的创伤较小，死亡率低，熟悉小脑延髓池的解剖后，可在短时间内掌握该方法，并顺利抽取到CSF。为利用大鼠CSF研究神经系统疾病进展，药物治疗反应的追踪和检测提供了简单易行的实验技术基础，可以降低实验难度，减少对大鼠数量、经费和实验设备的需求。小脑延髓池是临床中的一个解剖结构，位于小脑下面、延髓背侧面与枕鳞下部与颅后窝的后下部三者间。大鼠小脑延髓池外被硬脑膜覆盖的区域膜薄而质软，投射到颈部皮肤是在枕骨隆凸与第一颈椎之间。直视下穿刺小脑延髓池抽取CSF，虽然进针的解剖学定位更加明确，但需要分离颈部肌肉，手术操作难度大，损伤较显著，维持麻醉时间较长。由于穿刺部位临近延髓，有许多生命中枢，进针过深极易损伤延髓，导致大鼠神经功能受损，甚至死亡。经皮穿刺小脑延髓池抽取法可避免分离颈部肌肉的过程中血管破裂导致的CSF样本污染。同时避免微量进样器重复采样所致的样本交叉污染风险，能最大限度保留原有解剖结构，出针后肌肉组织的封闭阻挡可减少伤口感染的风险，能有效保证大鼠存活与恢复，有利于重复采样。

笔者在实践中，总结了如下操作要点：①以正握姿式持注射器，可增大手部对进针深度的控制力度，有效减少突破韧带和硬脑膜时刺入过深导致出血和伤及延髓的情况。②保证大鼠头部向前弯曲，相对于身体成45°～90°角，使枕骨大孔和第一颈椎之间的距离更明显，充分暴露穿刺部位。但头部过度弯曲也会减少硬脑膜和延髓表面之间的距离，从而增加了刺入脑干的风险，也可能导致呼吸道阻塞而死亡。③针尖向头侧进针，保持针头和头部弯曲的角度平行，进针深度约5 mm，针下有突破感后，应立即停止进针，右手食指缓慢施加微小负压，仔细观察是否抽取到澄清透亮的CSF；若无CSF，可略微向后移动针头。应避免继续向前深刺，这可能会增加损伤脑组织和穿刺出血的风险。④抽取CSF时负压不可过高，应缓慢抽取，采样量不宜超过100μL，否则可能因负压过大而导致血管破裂出血。⑤采样间隔不宜过短，本研究重复采抽取的间隔时间为2 d。若间隔短，穿刺后局部组织的肿胀无法恢复，使得再次穿刺时针感不明显，增加操作难度。⑥为提高CSF采集成功率及动物存活率，本文采用异氟烷气体吸入式麻醉方法。异氟烷诱导和复苏均较快，在体内代谢迅速，对各项生理指标及生命体征影响较小，有助于维持稳定的生理状态。异氟烷吸入麻醉给药方便，对剂量及麻醉维持时间具有良好的可控性，且具有明显的镇痛作用，有助于穿刺操作[26,27]。在实验中发现，穿刺失败后再次采样成功的CSF样本，虽外观已较为澄清透明，但其IL-6含量仍较高，提示穿刺失败造成的炎症损伤在短时间内难以恢复。虽然对比三次CSF样本的IL-6含量，脑组织伊文思蓝和HE染色的情况差异无统计学意义，其它反映脑损伤的指标是否改变，仍有待进一步的验证。故建议研究者根据实验目的进行有针对性的预实验，以确保该穿刺方法适用于特定研究内容。

本文提出了一种经皮小脑延髓池穿刺重复抽取大鼠CSF的实验方法。经验证该方法三次采样之间一致性较好，且短期内对大鼠生长发育和神经功能无显著影响。与其他穿刺方法相比，本方法具有操作简便，手术时间短，所需设备简单，对动物创伤小的优点。该方法为收集CSF样本提供了便捷的途径，其应用还可延伸至神经科疾病的建模、病情追踪和药物治疗。

基金资助:国家自然科学基金(补肾方对阿尔茨海默病CD33-TREM2-NF-κB信号通路的免疫调控及神经保护作用,No.82074362;基于肠道菌群-酪氨酸脱羧酶途径探讨升清降浊方调控左旋多巴代谢治疗帕金森病的机制,No.82204921);解码中医协同攻关项目(No.BZY-JMZY-202-002);中央高校基本科研业务费专项资金资助(No.2024-JYB-XJSJJ-008);

文章来源:姚路路,李傅尧,倪敬年,等.经皮小脑延髓池穿刺重复抽取大鼠脑脊液的方法研究[J].神经损伤与功能重建,2025,20(03):125-129.